электронный звон Потому что макрофаги специализируются на обнаружении молекул не-саморождения, они особенно трудно трансфект. Мы описываем протокол, который позволяет высокоэффективную трансфекцию первичных макрофагов с помощью мРНК, генерируемых из шаблонов ДНК, таких как плазмиды. Основным преимуществом нашего метода является то, что высокие показатели трансинфекции достигаются при отсутствии какой-либо обнаруживаемой цитотоксичности или иммуногенности.
Демонстрация процедуры будет Марк Херб postdoc из моей лаборатории. Начните с оттаивания всех компонентов комплекта транскрипции РНК. Вихрь реагентов в течение пяти секунд и спина их вниз в течение двух секунд на 2000 раз г, а затем держать их на льду до использования.
Подготовь реакцию транскрипции РНК в микроцентрифуге в 0,5-микролитерной трубке в соответствии с рукописными указаниями. Вихрь трубки и спина его вниз. Затем инкубировать его при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут при смешивании при 400 об/мин на тепловом миксере.
После инкубации добавьте два микролитров DNase I непосредственно в смесь реакции. Вихрь и спина трубки вниз, и инкубировать его в тепловой смеситель еще 15 минут. Зарезервировать двухмиберный алицит продукта, обработанного Dnase, для контрольного геля и хранить его при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
Для хвостохранилища полиА добавьте пять микролитров буфера реакции полимеразы 10X polyA и пять микролитров полимеразы полиА в реакцию, обработанную Dnase. Vortex и спина вниз смесь. Затем инкубировать его в термальный миксер в течение 30 минут.
Когда реакция будет завершена, возьмите алицит с двумя микролитровами для контрольного геля и храните его при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Добавьте 5-премьер-реагенты дефофорилирования непосредственно к хвостохранилищу полиА в соответствии с рукописными указаниями. Вихрь и спина вниз трубки, и инкубировать его в тепловой смеситель еще 30 минут.
Следуйте реакции дефосфорилирования с двухминутной инкубацией при температуре 80 градусов по Цельсию, чтобы нагреть инактивацию антарктической фосфатазы. Затем очистите транскрибированную мРНК в пробирке с помощью специального комплекта для очистки РНК. Измерьте концентрацию и чистоту элевированной мРНК с помощью микротомного спектрофотометра.
Вы запустите денатурированный гель агарозы с ранее собранными алицитами, чтобы проверить наличие одного продукта, правильную длину транскрипта и полиа хвостохранилище. Приготовьтесь к трансфекции, добавив предварительно рассчитанный объем буфера трансфекции мРНК за вычетом объемов трансфектного реагента мРНК и мРНК в реакционной трубке. Оттепель мРНК бульон и смешать его осторожно, листая трубку.
Затем добавьте предварительно рассчитанный объем мРНК в реакционной трубке. Vortex и спина вниз реакции смеси и мРНК трансфекции реагент, а затем добавить соответствующий объем мРНК трансфекции реагент реакции смеси трубки. Вихрь трубки и спина его вниз.
Затем инкубировать его при комнатной температуре в течение 15 минут. Тем временем замените культурную среду макрофагов свежей теплой культурной средой. После того, как инкубация трансфекции смесь завершена, добавить смесь пластины скважин, содержащих макрофаги dropwise и по кругу снаружи до середины колодца.
Для обеспечения равномерного распределения трансфекции смесь аккуратно раскачивает пластину в вертикальном и горизонтальном направлении. Затем инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа, по крайней мере шесть часов. После инкубации проанализируйте эффективность трансфекции с помощью флуоресцентной микроскопии, цитометрии потока или иммуноблот.
Наиболее важной частью этой процедуры является обеспечение равномерного распределения трансфектной смеси таким образом, чтобы все макрофаги соедеяли с одинаковым количеством мРНК. Этот протокол был успешно использован для генерации вариантов NEMO и IKK-бета с метками FLAG для трансфекции первичных макрофагов. Правильный размер и полиА хвостохранилище мРНК было проверено электрофорезом агарозного геля.
Эффективность трансфекции была подтверждена путем генерации мРНК, кодирующей GFP, и проведения анализа цитометрии потока. Скорость трансфекции увеличилась вместе с количеством трансфицированных мРНК, достигнув 50-65% для ТЧ и от 80 до 85% для BMDM. Как в ТЧ, так и в БМДМ уровень экспрессии ЭГПП в трансфицированных клетках увеличивался во времени и в зависимости от дозы.
Важно отметить, что анализ пропидия йодида-положительного или приложение V-положительных макрофагов подтвердил, что процедура трансфекции не вызывает литик или апоптотической смерти клеток. Эффективность трансфекции мРНК, кодирующих варианты Nemo или IKK-beta с тегами FLAG, были проанализированы с помощью иммунофлюоресценции микроскопии. Тарифы составили около 60% для Nemo mRNAs и 55% для IKK-бета mRNAs.
Этот протокол также использовался для генерации мРНК-кодирования рекомбиназы Cre. Трансфекция 400 000 BMDM с 400 нанограммами Cre recombinase mRNA привела к почти полному истощению белка Немо через 48 часов, что свидетельствует о высокоэффективной трансфекции. Отсутствие каких-либо обнаруживаемых количеств бета Interleukin 1, Интерлейкина-6 и фактора некроза опухоли указывает на то, что процедура трансфекции не активирует провоспалительные сигналы.
Наш относительно простой метод, наконец, позволяет эффективно выражать мутировавшие или помеченные белки в первичных макрофагах. Это существенно еще больше еще больше далее анализ функций макрофагов на молекулярном уровне.
