Воспроизводство является серьезной проблемой при индуцировании стволовых клеток, полученных кардиомиоцитов. Используя эти методы, высокая чистота и высокое качество кардиомиоцитов могут быть получены из iPS для их использования в функциональных исследованиях. Основным преимуществом этой методики является простой, надежный, рентабельный и чрезвычайно мощный метод получения очищенных, высококачественных препаратов кардиомиоцитов, полученных из iPSC.
Для промывки клеток, промыть клетки с одним миллилитром PBS без кальция и магния в течение семи до 10 минут, прежде чем заменить PBS с одним миллилитр прохожих среды. Используя клеточный подъемник, аккуратно соскребать клетки со дна колодцев и использовать стерильные двухми миллилитровые стеклянные пипетки, чтобы механически размежевать отдельные клетки. Когда клетки поднялись на небольшие кластеры, видимые под микроскопом, добавьте проходимую среду, чтобы разделить клетки в соотношении один-шесть.
Далее, аспирировать эмбриональной стволовой клетки человека квалифицированной матрицы из шести пластины хорошо. Затем добавьте один миллилитр прохожей среды и один миллилитр диссоциированных клеток к каждой хорошо, и пусть клетки растут, пока они не достигнут 70 до 80% слияния, прежде чем начать сердечную дифференциацию. По крайней мере за 30 минут до размежевывания iPSC-CMs, протрите отдельные стеклянные крышки скользит с 70% этанола, и поместите крышку скользит в отдельных скважин стерильных шесть пластины колодца.
Когда крышка скользит высохли, добавить от 250 до 300 микролитров человеческой эмбриональной стволовой клетки квалифицированного матричного раствора непосредственно на центр каждой крышки скольжения, и поместите шесть хорошо пластины в ткани культуры капот. Чтобы разобщить метаболически выбранный iPSC-CM добавить один миллилитр стерильного 0,25%трипсина с ЭДТА к каждому колодец в течение пяти минут инкубации при 35 градусах по Цельсию, и использовать 1000 микролитров пипетки механически разобщить клетки, пока одна клеточная подвеска была достигнута. Вытяните клетки в стерильной 15 миллилитров конической трубки, и мыть каждый хорошо с двумя миллилитров RPMI 20 средних на колодец.
Затем добавить моет в трубку и гранулы клеток центрифугации. Повторное увеличение клеток в достаточном объеме среды для достижения в три раза 10 до пятой клетки на 250 микролитров концентрации клеток. Используйте 1000 миллилитров пипетки наконечник разобщить клетки, пока решение не окажется однородным.
Затем аспирировать 250 микролитров клеток в 1000 микролитров пипетки наконечник, и медленно обойтись весь объем раствора на один эмбриональной стволовой клетки человека квалифицированных матричных закодированных крышка скольжения. Когда все клетки были посеяны, тщательно поместите пластину в инкубатор клеточной культуры на ночь. Аккуратно добавив два миллилитров D7 среды для каждого хорошо на следующее утро.
Когда выбранные iPSC-CMs достигают по крайней мере 3 месяцев старых обработать клетки с 2 microliters Fura-2 AM на 10 минут на 37 градусах Celsius, и сила на системе анализа кальция. Инициировать ArcLamp и подключить трубы от насоса к соответствующим вход и розетки и электронный провод от стимулятора к камере. Поместите камеру на систему.
Заполните трубку ProFusion, которая проходит через жидкий inlined нагреватель с 37 градусов по Цельсию нагревается раствор Тирод, и настроить камеру и обрамление размеров диафрагмы, чтобы свести к минимуму фоновую область. Закрепите стеклянную крышку, посеянную iPSC-CMs, в камеру и аккуратно добавьте 500 микролитров раствора Tyrode прямо поверх крышки. Начните обитать камеру с раствором Tyrode на 1,5 миллилитров в минуту скорости, и использовать электрический стимулятор для темпа IPC-CMs с 1 Герц поле стимуляции на 10 вольт каждые четыре миллисекунды в течение трех-пяти минут.
Когда все краситель был вымыт из камеры настроить смотровое окно в верхней левой области крышки скольжения, и начать запись. После сбора последовательного потока от пяти до 10 пиков нажмите паузу, чтобы временно остановить запись и переместить стадию микроскопа в соседнюю область для противоположного конца крышки скольжения перед возобновлением записи. После сканирования трансвестит кальция по всей крышке скольжения таким же образом в течение 10 минут анализировать данные с соответствующими флорескции трасс анализа программного обеспечения в соответствии с инструкциями производителя.
Этот протокол генерирует очень чистые кардиомиоциты, которые приобретают желудочковый, взрослый фенотип в культуре с течением времени. По оценке иммунофлуоресцентного окрашивания для предсердий и желудочков MLC2 изоформ, большинство клеток, генерируемых этим протоколом, являются предсердием MLC2 изоформы положительные в день 30 после индукции сердечной дифференциации. В то время как желудочковые MLC2 изоформы выражаются в большом количестве в то же время точки.
По мере увеличения времени в культуре наблюдается полный переход на изоформы MLC2. Эти данные были также подтверждены цитометрической количественной оценкой доли клеток маркера предсердий и желудочков MLC2. Амплитуда кальция значительно увеличивается в iPSC-CMs в день 90, подобно тому, что наблюдается для взрослых крыс CMs.
Важно отметить, что загрязнение не сердечных клеток может повлиять на функциональное созревание человека iPSC-CMs во время дифференциации. Кроме того, при записи преходящих кальция в iPSC-CMs необходимо позволить клеткам стабилизироваться при 37 градусах Цельсия при постоянной стимуляции в течение по крайней мере 200 секунд, и ограничить записи определенным временным окном, чтобы обеспечить воспроизводимые результаты. Не забудьте подтвердить, что iPSCs обладают однородной морфологии и позволить клеткам расти до 70 до 80% слияния до начала сердечной дифференциации.
Чистое качество в незрелых кардиомиоцитах, полученных iPS, может показать измененные функциональные характеристики, которые не отражают реальный фенотип, но могут быть неправильно истолкованы как больной фенотип. Поэтому получение чистых и высококачественных кардиомиоцитов важно для обеспечения последовательных и воспроизводимых результатов.
