В этом видео, мы демонстрируем, как выразить экзогенные конструкции ДНК в оптических нейронов и как изображение отдельных GFP-экспрессии оптических аксональных беседки в нетронутыми, живые Xenopus laevis головастики. Это недорогая, простая процедура для преходящих клеточных трансгенезов, которая позволяет определить функцию клеточного автономного гена в отдельных оптических аксональных беседках, развивающихся в живой позвоночной модели системы. Демонстрация процедуры будет я, София Дао, научный сотрудник, и д-р Тамира Элул, лаборатория главный исследователь.
Для начала аккуратно обрезайте кончик вытащил стекла микро капиллярной пипетки с тонкой типсов. Заполнюйте стеклянную микро капиллярную пипетку минеральным маслом с помощью MICROFIL так, что крошечная капля минерального масла появляется на обрезанном кончике микро pipette. Заполните стеклянный микро капиллярный пипетку на полпути с минеральным маслом.
В инжекторе, извлечь поршень на полпути и загрузить вытащил стекла микро капиллярной пипетки в держатель впрыска. Затем удлинить поршень в полной мере, чтобы подтвердить, что микро капиллярная пипетка сильно прикреплена к инжектору и не двигается с расширением поршеня. Перенесите три капли микролитров смеси ДНК/DOTAP на квадратный лист парафиновой бумаги на один дюйм.
Под стерео рассечение микроскопа, переместить кончик стекла микро капиллярной пипетки в ДНК / DOTAP падение. Используйте опцию заполнения на инъекционный аппарат, медленно сосать ДНК / DOTAP падение в стекло микро капиллярной пипетки. Граница между минеральным маслом и раствором ДНК/DOTAP видна в стеклянной микрокапсиллярной трубе из-за небольшой непрозрачности раствора ДНК/DOTAP.
При необходимости, прекратить заполнение микро капиллярной пипетки периодически, чтобы давление в стеклянной микро капиллярной пипетки для перекалибровки. Во-первых, в 10 миллилитров Петри блюдо заполнено 0.1X MMR, вручную de-vitellinize 10 этап от 20 до 24 Xenopus эмбрионов с тонкой типсов. Возьмите конверт вителлина на талии, чтобы избежать травм эмбрионов.
С помощью типсов в левой и правой руке экспериментатора, поп пузырь вителлин конверта и освободить эмбрион из конверта вителлина. Позаботьтесь, чтобы не повредить эмбрионы при удалении конверта вителлина. Затем используйте пластиковую трубку передачи с разрезом наконечник для передачи от пяти до 10 де-vitellinized этапе от 22 до 24 эмбрионов в 10 миллилитров Петри блюдо заполнено 1X MMR.
Под стерео микроскопом схватите один из девителлиозных эмбрионов в чашке Петри типсами и устроите эмбрион так, чтобы его передний полюс был направлен в поле зрения. Затем сориентировать эмбрион так, чтобы он лежал боковой и один из его лево-правого глаза почки сталкивается вверх. Держите эмбрион с типсами в недоминной руке экспериментатора и с доминирующей рукой экспериментатора, ввемите кончик стеклянной микротупети с брюшной или спинной стороны прямо под эпидермисом в глазной бутон.
Ввись от 70 до 210 нанолитров раствора ДНК/DOTAP. Затем поверните эмбрион вокруг и выполнить тот же микро-инъекции в другой глаз бутон на контралатеральной стороне эмбриона. Инъекции обоих глазных почек от шести до 10 эмбрионов в каждом эксперименте.
После микро-инъекций, хранить эмбрионы в чашке Петри с 1X MMR в течение примерно 30 минут, чтобы облегчить заживление ран. Через 30 минут перенесите вводимые эмбрионы с пластиковой переносной пипеткой в раствор 0.1X MMR с 0.001% отбеливающим агентом фенилтиокарбамид для уменьшения пигментации. Обложка чашки Петри с крышкой для культуры эмбрионов в течение примерно пяти дней, пока эмбрионы превратились в головастиков на этапах 46 до 47.
Этот протокол дает успех от 30 до 60% инъекционных эмбрионов Xenopus, выражают GFP в 1 до 10 оптических аксональных беседок. Представитель конфокальные изображения GFP показывают выражение контроля и мутантных оптических аксональных беседок в нетронутых головастиков Xenopus. Два доменных мутанта БТР, APCNTERM и APBbeta-кошка были клонированы в плазмиды pCS2.
Были реконструированы снимки управления GFP и APC мутантных аксональных беседок. Участки количества ветвей, общая длина ветви беседки и средняя длина ветви подтверждают наблюдаемые различия между контролем и мутантом БТР, выражают аксональные беседки. Дополнительные участки рассеяния числа ветвей по сравнению со средними длинами ветви с линиями регрессии показывают обратную корреляцию между этими параметрами и оптическими аксональными беседки, выражают домены APC.
Кончик микро капиллярной пипетки должны быть правильно вставлены очень поверхностно в глаз бутон так, что серый эпидермис чрезмерно глаз бутон набухает во время каждой микро-инъекции. Эта процедура может быть использована как для обозначения и изменения конкретной генетической функции в оптических нейронов при оценке роста, ориентации и ветвления аксонов из этих оптических нейронов. Этот метод микро-инъекций ДНК и липофекции позволил исследователям в нейробиологии развития изучать клеточные автономные молекулярные механизмы, которые регулируют оптическую арборизацию аксона в нетронутых, живых головастиках Xenopus laevis.
