Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в приемной передачи клеток iPSC полученных вирусных антиген-специфических Т-клеток для эффективного подавления репликации HBV у мышей. Основным преимуществом этой техники является то, что iPSC полученных вирусных антиген-специфических Т-клеток имеют один тип Т-клеточных рецепторов и наивный фенотип. Для дифференциации HBV-специфических iPSC CD8-положительных Т-клеток, пластина s183 T-клеточных рецепторов ген-трансфуцированных iPSCs на OP9-DL1/DL4 монослой в альфа-минимум среды дополняется 20%фетальной сыворотки крупного рогатого скота и murine Flt3 лиганд для их совместной культуры в инкубаторе клеточной культуры.
Регулярно следите за совместной культурой для оценки морфологии клеток. На 28-й день удалите супернатантные и плавающие клетки и отсоедините клетки-адепты 0,25%трипсином. Когда клетки поднимаются со дна контейнера культуры, остановить энзиматической реакции с восемью миллилитров iPSC среды, и собирать клетки центрифугации.
Переусердуйте гранулы в 10 миллилитров свежей среды. Разбавить клетки до одного iPSC-производных CD8-положительных Т-клеток до четырех s183 пептид-импульсный спланоцитов соотношение для 40-часовой инкубации в инкубаторе клеточной культуры. В течение последних семи часов добавьте в культуру четыре микролитера разбавленного брефельдина А, чтобы блокировать транспортные процессы во время активации ячейки.
Пятно клеток для потока цитометрического анализа внутриклеточных цитокинов, представляющих интерес в соответствии со стандартными протоколами. Для гидродинамической плазмидной доставки HBV через хвостовую вену разбавляют 10 микрограммов плазмиды HBV в 8%эквивалентной массе тела PBS. Загрузите плазмид в один трехми миллилитровый шприц, оснащенный 26-дюймовой иглой на мышь.
Нагрейте мышей HHD под тепловой лампой в течение пяти минут, чтобы расширить хвостовые вены, и осторожно потяните мышь в пластиковый хеверитель. Найдите расширенную боковой хвостовой вены в средней трети хвоста и вставьте иглу параллельно вене, чтобы доставить весь объем плазмиды через хвостовую вену в течение трех-пяти секунд. Для вирусных антиген-специфических iPSC-производных CD8-положительных Т-клеток приемной передачи клеток, собирать iPSC CD8-положительных Т-клеток на 22-й день культуры, как попродемонстрировано, и семян клеток на новый 10-сантиметровый элемент культуры блюдо.
После 30 минут в инкубаторе культуры клеток, фильтруйте плавающие клетки через 70-микрометровый нейлоновый ситечко, и подсчитайте жизнеспособные клетки. Разбавить клетки в 1,5 раза от 10 до семи клеток на миллилитр концентрации PBS. Ввими 200 микролитров клеток в отдельных четырех-шестинедельных мышей HHD, в хвостовую вену, как только что продемонстрировано.
На 14-й день после переноса ячейки выполните гидродинамическую плазмиду HBV, как это было продемонстрировано. В соответствующих экспериментальных конечных точках после заражения, урожай печени от каждого инфицированного животного, и сократить печени на 0,5-на-0,5 на 0,3-сантиметровой ткани образцов. Поместите образцы в 10%нейтральный буфер формалин в течение четырех-24 часов, а затем декалкации в 2,5-молярной формовой кислоты в течение шести-24 часов.
Затем промыть образцы в ксилене в течение трех минут, а затем две две минуты полоскания в 100% этанола, 95% этанола, и деионизированной воды. После последнего мытья воды, decalcify тканей в один миллимолярной EDTA при температуре 90 градусов по Цельсию, а затем 30-минутный инкубации при комнатной температуре. Когда ткань остынет, промыть образцы в PBS в течение четырех минут, и использовать ксилен и этанол для депарафинизации и регидратации образцов.
Для иммунофлуоресцентной маркировки, пятно разделов с 200 микролитров ВГВ поверхности антиген-специфических антител в течение двух часов при комнатной температуре в 75 до 100% увлажненной камеры. В конце инкубации, мыть образцы с пятью пять минут моет в свежем PBS для каждой стирки. Наклеить клетки с DAPI в соответствии со стандартными протоколами перед монтажом слайдов с крышками для визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии.
Для иммуногистохимического анализа, пятно разделов с гематоксилином и эозином в соответствии со стандартными протоколами, и оценить проникновение воспалительных клеток в печень с помощью легкой микроскопии. Поток цитометрического анализа iPSC полученных CD3-положительных CD8-положительной популяции показывает, что HBV Т-клеток рецепторов трансдукции резко увеличивает генерацию вирусных s183-специфических CD8-положительных Т-клеток. После стимуляции с Т-обедненных спеноцитов пульсировал с s183 пептид, CD4-отрицательный CD8 одно-положительных IPSC полученных Т-клеток производят большое количество интерферона гамма, как обнаружено внутриклеточного потока цитометрического анализа и ELISA.
После инфекции ВГВ путем гидродинамической инъекции репликация ДНК достигает пика на шестой день и постепенно уменьшается, как это наблюдается при анализе ПЦР в режиме реального времени. Кроме того, вирусная репликация значительно снижается в любое время точки у мышей, которые получают HBV вирусных антигенных конкретных Т-клеток по сравнению с мышами, которые получают контрольные клетки. HBV поверхностный белок также существенно снижается у мышей, которые получают HBV вирусный антиген-специфических до iPSC цитотоксических лимфоцитов по сравнению с мышами, обработанных контрольными клетками, ясно демонстрируя, что вирусный антиген-специфический iPSC CD8-положительные Т-клетки имеют возможность уменьшить репликацию HBV в модели murine.
Теперь вы должны иметь хорошее понимание того, как генерировать вирусные антиген-специфические Т-клетки из iPSC для приемной иммунотерапии.
