Detrusor гладкие мышечные клетки образуют стенку мочевого пузыря, что в конечном итоге облегчает аннулирование мочи и хранения. Наш протокол обеспечивает проверенный и надежный метод для свежеизоляции одиночных гладких мышечных клеток. Свежеиспобранные человеческие детрусорные гладкие мышечные клетки дают возможность для электрофизиологических и молекулярных исследований на уровне одной клетки.
Изучая одиночные детрусорные гладкие мышечные клетки из-под контроля, нормальных и больных мочевых пузырей человека, у нас есть возможность проверить фармакологические цели, такие как ионные каналы. Одиночные человеческие детрусорные гладкие мышечные клетки идеально подходят для электрофизиологических экспериментов, таких как электрофизиология патч-зажима. Здесь мы представляем пример изучения одного ионового канала под названием TRPM4, переходного рецептора потенциального меластатина четырехканала, который является неселективным каналом катиона.
Новички могут бороться с вскрытием и энзиматической лечения шаги, которые требуют эффективности и знакомства, включая признание важнейших важных шагов для получения свежих изолированных клеток DSM. Важно быть знакомым с гистологией мочевого пузыря человека, протокольные шаги для изоляции одиночных клеток остаются устойчивыми, и первоначально ожидают получить неоптимальные клетки с помощью этого протокола. Начните с изучения всей толщины мочевого пузыря образца.
Прикрепите образец, слизистую оболочку лицом вверх и серозу вниз на силиконовую энантиомерную круглую тарелку диаметром 150 мм, наполненную ледяным DS, и аккуратно удалите всю слизистую оболочку острым вскрытием. Вырежьте несколько слизистой оболочки свободной детрусора гладкой мышцы или DSM штук. Поместите три-шесть частей DSM в трубку с одним-двумя миллилитров предварительно разогретых DS, содержащих папаин и дитиотрейтол, или DS-P.
Инкубировать их при 37 градусах по Цельсию в течение 30 до 45 минут, убедившись, что встряхнуть трубку каждые 10 до 15 минут. После инкубации, удалить DS-P из трубки и кратко мыть DSM штук с ледяной DS. Перенесите DS с DSM частей в новую трубку и удалить DS, оставляя DSM штук в нижней части трубки. Добавьте в трубку от одного до двух миллилитров DS, содержащих коллагеназу II типа, или DS-C.
И инкубировать его при 37 градусах по Цельсию с редким встряхивания. Отбросьте DS-C и промыть фермент обработанные DSM штук пять-десять раз с ледяной DS. После последней стирки оставьте DS внутри трубки, и аккуратно тритурировать куски с огнем полированной пипетки Пастер выпустить одиночные клетки DSM. Пипетка от 0,25 до одного миллилитров клеточной подвески на стеклянную нижнюю камеру, сидящую на стадии перевернутого микроскопа, и инкубировать его в течение по крайней мере 45 минут, чтобы клетки придерживаться.
Затем удалите DS из ванны и замените его раствором E с помощью суперфузии. Потяните несколько электродов патч, огонь-полировать электрод советы, и пальто советы в зубной воск, если это необходимо. Заполните кончик электрода патча раствором пипетки без амфотерицина-B, ненадолго окунув электрод в раствор.
Успех электрофизиологии зажима патча зависит от качества клеток DSM и амфотерицин-B solubilization. Заполнюте электрод тем же раствором пипетки, содержащим амфотерицин-В, и смонтировать электрод на держатель, подключенный к головке усилителя патча. Используйте микроманипулятор, чтобы поместить электрод чуть ниже поверхности внеклеточного раствора так, чтобы кончик электрода просто погрузился.
Затем определите сопротивление электрода с помощью функции мембранного испытательного окна программного обеспечения коммерческого приобретения и процдимите электрод к ячейке, представляющие интерес. При прикосновении к поверхности клетки с электродом, образуют гига-печать, применяя мягкое быстрое отрицательное давление на электрод через трубки. Это приводит к отрицательному давлению на кончике электрода, что приводит к успешному гига-уплотнению, что подтверждается мембранным тестом.
Разрешить от 30 до 60 минут для амфотерицин-B, чтобы рассеять вниз пипетку и быть вставлены в плазменной мембране, образуя поры в первую очередь избирательно к моновалентным cations. Продолжить мониторинг гига-печать с функцией мембранного теста. Когда перфорация патча оптимальна, отмените переходные емкости, отрегулив циферблаты для емкости ячейки и сопротивления рядов на усилителе.
После того, как наблюдаются стабильные катионые токи напряжения, записывают токи с протоколом напряжения-шага маршрутизации, как описано в рукописи. Применить соединение или физиологическое состояние теста, чтобы проверить с помощью суперфузии и записывать ответы на контроль и испытания условий, а также вымывания. Этот протокол может быть использован для изоляции здоровых, свежих клеток DSM для функциональных и молекулярных исследований.
Здоровые одиночные клетки DSM охарактеризованы морфологией шпинделя, хрустящими наилучшим образом определенными краями, наилучшим образом определенным ореолом вокруг клетки, и semi-contractile возникновением когда осмотрено под микроскопом. Кроме того, недавно изолированные DSM-клетки реагируют на механическую стимуляцию и карбахол. Фрагменты клеток и не жизнеспособные или чрезмерно переваренные клетки следует избегать в последующих экспериментах патч-зажим.
Изолированные клетки были использованы в амфотерицин-B перфорированных патч-зажим экспериментов, где цельноклеточные токи были измерены либо напряжение шаг индуцированной или рампы протокола в трех различных человеческих DSM-клеток. Эксперименты показали, что 9-фенанотр, ингибитор канала TRPM4, эффективно и обратимо ингибирует человеческие токи DSM-катиоций. 9-фенатрол чувствительных текущий компонент иллюстрирует более сильное торможение при положительном напряжении и внешнего исправления.
Состояние ферментативных шагов лечения, шаги 2.2 и 2.3, включая температуру, продолжительность ферментной обработки, источники ферментного лота и качество клеток DSM, являются ключевыми детерминантами для получения высококачественных клеток DSM человека. Клетки DSM человека также идеально подходят для оценки внутриклеточного второго уровня посыльного, включая кальций и циклический AMP, обнаружение белковых выражений иммуноцитохимией и совместное выражение путем анализа проксимальных судебных процессов на месте, а также экспрессию мРНК с помощью RT-PCR, qRT-PCR, microarrays и секвенирования следующего поколения. Клетки DSM человека продвинули наше понимание роли каналов БК, кальция, TRPM4 в мочевом пузыре.
Будущие разработки позволят конкретно связать электрофизиологические или фармакологические свойства с профилями транскриптома или протеома.
