Исследование взаимодействия белка и белка необходимо для понимания физиологических процессов в нескольких сферах. В этом видео мы вводим на мембране метод пищеварения, который позволяет исследователям выполнять всеобъемлющий анализ связывающих белков MS в удобной манере. Основным преимуществом этой методики является то, что мы можем улучшить пропускную способность протеомного анализа на грубые иммунопреципианты, потому что разделение белков полиакриламинидным гель электрофорезом не является необходимым.
Начните спряжение антитела к магнитным бусинкам, смешивая анти-GFP антитела с бисером в 500 микролитров фосфатного буфера цитрата. Поверните смесь при температуре 50 об/мин в течение одного часа при комнатной температуре. А затем мыть конъюгированные бусы три раза с цитрат фосфат буфер, содержащий 1%полисорбат 20.
Lyse трансфицированных клеток в соответствии с рукописными указаниями. Очисти блюдо и перенесите лисат в 1,5 миллилитровую пробирку. Затем очистить лизат путем центрифугирования на 15000 х г в течение пяти минут и собирать супернатант.
Подготовье неотрещенных магнитных бусин, мыть их три раза с 500 микролитров цитрат фосфатного буфера. После окончательной стирки снимите буфер и добавьте лисат ячейки к бисеру. Поверните смесь при температуре 50 об/мин в течение 30 минут при комнатной температуре.
Выполните магнитное разделение на магнитной подготе и соберите лисат клетки. Чтобы связать целевые белки с конъюгированными бусинами иммуноглобулина, поместите шарики на магнитную подстворку в течение пяти минут. Отбросьте буфер цитрата и добавьте лизат клетки к бисеру.
Поверните смесь в течение одного часа при 50 об/мин. Чтобы отделить целевые белки от свободных нецелесочных белков, мыть бисер три раза с 500 микролитров фосфатного буфера, содержащего 1%полисорбат 20. После окончательной стирки добавьте 30 микролитров буфера цитратов и дайте бисеру сидеть в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы утоить целевые белки.
Чтобы подготовить мембрану, разрежьте мембраны PVDF на 3 миллиметра на 3 миллиметра с помощью хирургических ножниц, которые были очищены непосредственно перед использованием. Поместите кусочки мембраны на алюминиевую фольгу и добавьте два-пять микролитров этанола к каждому куску. Прежде чем мембраны полностью высохнут, добавьте к каждому куску от двух до пяти микролитров белка элюента и высушите их до тех пор, пока поверхность мембраны не станет матовой.
Затем перенесите мембраны в 1,5 миллилитровые трубки и храните их при четырех градусах Цельсия. При немедленном использовании добавьте от двух до 30 микролитров этанола, которые сделают их гидрофильные. Удалите этанол с пипеткой, но прежде чем мембраны высохнут, полностью добавьте 200 микролитров раствора реакции на основе DTT в каждую трубку, и инкубировать их при 56 градусах по Цельсию в течение одного часа.
После инкубации замените раствор реакции 300 микролитров раствора идоацетамида и инкубировать в темноте в течение 45 минут. Затем мыть мембраны дважды с дистиллированной водой и один раз с 2%acetonitrile путем вихря, по крайней мере десять секунд. Работа с диафанным ацетонитрилом может быть чрезвычайно опасной.
Маску, очки и перчатки всегда следует носить при выполнении процедуры пищеварения на мембране. Приготовьте трипсин в соответствии с рукописными указаниями и добавьте 100 микролитров трипсинной реакции раствора к каждой мембране. Инкубировать на ночь при 37 градусах по Цельсию для пищеварения.
На следующий день перенесите раствор реакции в чистую 1,5 миллилитровую трубку и добавьте в мембрану 100 микролитров растворов для мытья. Инкубировать мембрану при 60 градусах по Цельсию в течение двух часов, затем собрать раствор для мытья и смешать его с реакционным раствором. Добавьте еще 100 микролитров раствора для мытья в мембрану и sonicate его в течение 10 минут.
Затем соберите раствор для мытья и смешайте его с реакционным раствором. Обложка пробирку с куском лабораторной пленки и сделать небольшие отверстия в пленке с иглой. Высушите раствор с помощью вакуумного концентратора и растворите остаток в 10 микролитров 2%-процентной кислоты.
Центрифуга трубки на 12000 х г в течение трех минут, и передать супернатант в образец трубки. Проанализируйте образец с помощью масс-спектрометра, связанного с системой nano LC/HPLC. Используя этот протокол, 17 белков были определены в Calpain-6 связанных иммунопреципиентов, 15 в GFP связанных иммунопреципиента, и 11 были определены в обоих.
Важно отметить, что обнаружение по крайней мере одного высокой точности пептидного фрагмента требуется для положительной идентификации белка-кандидата. Белки, которые осаждались в лисате GFP-экспрессирования, а также гистоны, экзогенные и рибосомные белки были исключены из списка. Мытье мембран перед триптическим пищеварением с дистиллированной водой и 2%acetonitrile является наиболее важным шагом в процедуре переваривания на мембране над белками.
Следуя этому методу, можно подтвердить совместное выпадение целевого белка путем проведения других экспериментов, таких как иммунопреципиентация и западный анализ помарки. Этот простой метод позволяет исследователям исследовать новые белково-белковые взаимодействия с удобным и высокочувствительным анализом.
