Наш протокол представляет собой простую в использовании и недорогую технику эпидермально-дермального разделения для определения специфической для участка выработки медиаторов воспаления и нейротрофиных препаратов при воспалении кожи. Основным преимуществом данной методики является то, что ферментативное отделение эпидермиса от дермы выполняется при четырех градусах Цельсия, сохраняя целостность мРНК и белка. Этот метод дает представление о типах медиаторов, которые сенсибилизируют первичные афферентные терминалы во время острого и хронического воспаления для разработки новых терапевтических вмешательств.
Заживление ран, кожные заболевания, хронические раны и ожоги могут извлечь выгоду из этого исследования. И этот метод может быть применен к другим эпителиальным поверхностям, таким как желудочно-кишечный тракт и роговица. Оптимальное время разделения может незначительно отличаться между лабораториями.
Для определения качества разделения рекомендуется провести предварительный эксперимент, сравнивающий различные временные точки в сочетании с оценкой 2D-морфологии. После подтверждения отсутствия реакции на педальный рефлекс у анестезируемой восьми-девятинедельной крысы Sprague Dawley, подкожно вводят в правую глянцевую заднюю лапу 100 микролитров 1X Lambda carrageenan, разбавленного в PBS. Используйте суппорты для измерения толщины плюсневой кисти задней лапы непосредственно до и через 6 и 12 часов после инъекции, чтобы определить объем отека в ответ на раздражитель.
В соответствующей экспериментальной конечной точке используйте острый скальпель, чтобы собрать один или два миллиметра кусок гламурной кожи задней лапы с введенной лапы и использовать микродиссекционные щипцы для переноса кожи в один миллилитр холодного DMEM в микроцентрифужной трубке на льду в течение 15-60 минут. Пока ткань инкубируется, добавьте один миллилитр свежеприготовленного активированного термолизина в 10 лунок 24-луночной пластины для культивирования клеток на льду. В конце инкубации используют микродиссекционные щипцы для переноса одного образца кожи в каждую скважину активированного термолизина, рогового слоя стороной вверх без погружения образцов в раствор.
Очень важно, чтобы кожа не погружалась в термолизин и чтобы роговой слой был обращен вверх для достижения эффективного разделения. Через два-три часа используйте щипцы микродиссекции, чтобы погрузить один образец кожи в семь-восемь миллилитров четырех градусов Цельсия DMEM в чашку Петри, чтобы дать больше места для отделения эпидермиса от дермы. Используйте щипцы, чтобы аккуратно расчесать эпидермис по периметру кожи до тех пор, пока на границах образца не будет наблюдаться почти полупрозрачный эпидермис.
Когда эпидермис заметно отделится от дермы, тщательно схватите каждый слой кожи одной парой щипцов и медленно вытяните эпидермис из дермы, затем оцените полупрозрачность изолированного эпидермиса с помощью световой микроскопии, чтобы убедиться, что он оптически согласован. Если слои были правильно разделены, поместите эпидермальные и дермальные ткани в отдельные контейнеры с пятью миллимолярными ЭДТА в ДМЭМ при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут. После дезактивации термолизина зафиксируйте часть эпидермиса в соответствующем фиксаторе на один час при комнатной температуре с перемешиванием.
В конце инкубации поместите неподвижную ткань в 10% сахарозу в PBS в течение одного часа при комнатной температуре с перемешиванием, прежде чем заморозить образец в подходящую ткань, встраивающую матрицу для сечения. Используйте криостат для получения поперечных сечений толщиной 14 микрометров и оттаивания, установите секции на стеклянные стекла микроскопа с желатиновым покрытием. После высыхания на слайдовом грелке окрашивают образцы рабочим раствором толуидина синего цвета в течение 90 секунд.
После этого осторожно смойте толуидиновый синий со слайдов с PBS и противопоставьте облицовочные листы водной монтажной средой, затем наблюдайте эпидермис с помощью микроскопии Брайтфилда с увеличением от 50 до 250X. Инъекция каррагинана в заднюю лапу крысы вызывает классические симптомы воспаления, такие как покраснение и отек как через 6, так и через 12 часов после инъекции. Микроскопия Брайтфилда может быть использована для оценки эффективности разделения термолизинов эпидермиса и дермы глазчатой кожи задней лапы крысы.
Действительно, толуидиновым синим окрашиванием эпидермальных поперечных сечений показывает, что эпидермис отделен от дермы на исходной мембране, но что эпидермальные гребни Рете и вмятины от дермального сосочка остаются нетронутыми. Далее наблюдаются все клеточные слои кератиноцитов. Западное блоттирование отделенного термолизином эпидермиса дает последовательные результаты, указывающие на стабильные уровни белка во время техники на уровне четырех градусов Цельсия.
Очень мало белка NGF обнаруживается в наивном эпидермисе крыс, но уровни белка NGF значительно повышаются после шести часов воспаления, вызванного каррагинаном. Через 12 часов после инъекции уровни NGF снижаются по сравнению с теми, которые наблюдаются через шесть часов, но остаются повышенными по сравнению с контрольной частью. Как и ожидалось из анализа вестерн-блот, иммунореактивность NGF не обнаруживается в наивных контрольных образцах ткани эпидермиса, но через шесть часов после воспаления, вызванного каррагинаном, иммунореактивность NGF наблюдается в большинстве кератиноцитов гранулезного слоя и луцидного слоя.
Несколько клеток в расщеленном слое также являются иммунореактивным NGF. При использовании термолизина для выделения интактного эпидермиса важно помнить, что оптимальное время разделения должно быть эмпирически определено конечным пользователем. Различные протеомные и молекулярные методы могут быть использованы для проверки экспрессии специфических белков и / или первичных транскриптов генов, чтобы подтвердить, что эта процедура не изменяет базальную экспрессию.
Этот метод эпидермально-дермального разделения позволит исследователям ответить на дополнительные вопросы, касающиеся сайт-специфической экспрессии нейротрофиных и воспалительных медиаторов в различных моделях кожного воспалительного отдела. Пикриновая кислота и параформальдегид опасны. Работайте с обоими химическими веществами в вытяжном капюшоне, используйте индивидуальную защитную одежду и перчатки и мойте лицо и руки после обработки.
