SEC-MALS является количественным методом для определения молекулярного веса, размера и конформации макромолекул в растворе. Он может идентифицировать олигомеры и комплексы, а также характеризовать сложные образцы, такие как гликопротеины и мембранные белки. SEC-MALS является абсолютным методом.
Она опирается на фундаментальную физику и не зависит от сотрудничества с молекулярными стандартами, конформацией молекулы или тем, как мы взаимодействуем со средой разделения. SEC-MALS может быть применен ко многим системам, которые разделены sec. От пептидов и мелких полимеров до белков, нуклеокапсидов, полисахаридов, синтетических полимеров, вирусопоялных частиц и мелких вирусов.
Важно убедиться, что ваша система и буферы не содержат рекомендаций поставщика относительно низкого содержания твердых частиц. Проконсультируйтесь с представителем технической поддержки поставщика, чтобы быть уверенным. Начните эту процедуру с подготовки системы SEC-MALS, как описано в текстовом протоколе.
Используя каждый реагенты plc-класса, подготовьте один литр фосфатно-буферного солевого раствора с хлоридом натрия от 50 до 100 миллимолярдов. Фильтр буфера до 0,1 микрона с помощью разлитого в бутылку фильтра пены полиэтер клеток, или аналогичный. Фильтр первых 50 до 100 миллилитров буфера в бутылку отходов, с тем чтобы устранить частицы из сухих фильтров.
Затем отфильтруй остаток в чистую стерильную бутылку, которая ранее промылась фильтрованной, деионизированной водой и хранилась для предотвращения поступления пыли. Промыть столбец на ночь со скоростью потока 0,5 миллилитров в минуту, чтобы уравночные колонны в буфере и удалить частицы. Используйте режим непрерывного потока FPLC и убедитесь, что поток не остановится до тех пор, пока не будут завершены все запуски SEC-MALS.
Поместите ячейку потока DRI в режим чистки во время ночного флеша. При начале флеша постепенно увеличивайте скорость потока, чтобы предотвратить эффект пролития столбца, вызванный внезапной сменой давления в столбце. Выключите очистку перед началом пробных запусков.
Проверьте чистоту системы, слегка нажав трубки вниз по течению от столбца, чтобы освободить накопленные частицы. Наблюдайте за сигналом в детекторе 90 градусов на дисплее передней панели прибора MALS. Убедитесь, что пик-пик шума не более 50-100 микровольт.
Также убедитесь, что рефракционный индекс, или RI-сигнал, стабилен менее чем в 1 раз в десять до минус семи рефракционных единиц индекса. Выполните пустую инъекцию, чтобы убедиться, что инжектор чист от частиц. Пустой - это просто бегущий буфер, приготовленный в свежем стерильном флаконе.
Если пик частиц не превышает одного миллилитра в объеме и не более пяти милливольт выше базового уровня, то система готова к образцам. В противном случае, выполнять дополнительные пустые инъекции до чистой, или выполнять техническое обслуживание для очистки инжектора. Теперь подготовь по крайней мере 200 микролитров BSA по одному-двум миллиграммам на миллилитр в буфере SCC.
Фильтр белка до 02 микрон, используя фильтр кончика шприца. Отбросьте первые несколько капель фильтрата, чтобы исключить частицы из сухих фильтров. Кроме того, центрифуга образца в 10 000 раз G в течение пятнадцати минут, чтобы обеспечить осадки нерастворимых агрегатов и других крупных частиц.
Затем ввеми 100 микролитров раствора BSA в петлю. Откройте новый эксперимент с методом в программном меню MALS. Затем выберите онлайн-метод из папки методов рассеяния света.
Если детектор DLS присутствует, выберите онлайн-метод из рассеяния света с папкой «ЗЕЛС». Установите параметры образца и мобильной фазы в разделе конфигурации. В общем представлении насоса установите скорость потока на скорость, используемую в FPLC.
Затем перейдите на общий вид насоса, ветвь растворителя, поле имен и выберите PBS. В представлении инжектора, ветке образца, введите имя как BSA. Установите dn/dc до 0.185, установите A2 к 0 и установите коэффициент УФ-вымирания до 0,667 миллилитров на миллиграмм сантиметра.
В разделе процедур базовое представление коллекции выберите триггер checkbox на автоматическом впрыске. Установите продолжительность пробега до 70 минут, чтобы данные собирались для всего аллюзии, пока не будет достигнут общий объем пронизывания столбца SEC. Начните эксперимент в программном обеспечении MALS, нажав кнопку запуска.
Он начнет считыв данные после получения импульсного сигнала от прибора FPLC через детектор MALS. Нулевой сигнал DRI, нажав кнопку автоматического нуля на передней панели инструмента. Работая в программном обеспечении FPLC, перейдите на руководство, выполняйте инструкции, установите отметку и вставьте название белка и пробег.
Переключите клапан впрыска с ручной нагрузки на впрыск, под траекторию потока, инъекционный клапан. Включите импульсный сигнал, вставив 0,5-секундный импульс под io-бокс импульс цифровой из. Это вызовет сбор данных в программном обеспечении MALS.
Теперь ввими образец в петлю. Нажмите выполнить в программном обеспечении FPLC, чтобы начать эксперимент запуска. Выполняем анализ шаг за шагом, в разделе процедур в программном обеспечении MALS.
Убедитесь, что пики отображаются примерно на томе аллюзии в UV, MALS и RI, проверив базовое представление коллекции. В базовом представлении определите базовый уровень для всех сигналов. В представлении пиков определите пики, которые необходимо проанализировать, нажав и перетащив мышь.
Выберите центральные 50% каждого пика. Сначала выберите мономерный пик, а затем пик димера. Под каждым пиком проверяйте правильные значения dn/dc и коэффициент вымирания на уровне 280 нанометров для BSA.
В процедурах, выравнивание зрения, выберите центральную область пиков, нажав и перетащить мышь. Нажмите выровнять сигналы, а затем хорошо. В процедурах, диапазон расширения зрения, выбрать центральный 50% мономерный пик.
Убедитесь, что детектор рефракционного индекса указан в качестве эталонного инструмента. Затем нажмите выполнить нужным, и применить в матче УФ и свет рассеяния сигналов к рефракционного сигнала индекса. Увеличьте пики, чтобы убедиться, что они очень тесно перекрываются в пределах центральных 50 до 70%, а затем нажмите хорошо.
В процедурах, нормализации зрения, выберите пик один. Введите 3,0 нанометров, как значение RG, нажмите нормализовать, а затем нажмите хорошо. Просмотр графика результатов в представлении графика EASI.
Выберите молярную массу с дисплея, опустите ее в верхней части окна. Используйте элемент управления, нажмите кнопку и перетащите, чтобы увеличить область пика. Чтобы просмотреть окончательные результаты средней молярной массы в таблице для мономерных и затемненных пиков, перейдите к пиковым результатам, молярным массовым моментам, МВт и выберите результаты, сообщите резюме.
Чистота сообщается при пиковых результатах, массовая фракция. Из меню файлов выберите сохранить в качестве метода, и сохранить проанализированные данные BSA в качестве стандартного метода для будущих измерений всех типов белков. Нормализация и расширение полосы параметров, определенных для BSA, будут перенесены в анализе.
Здесь показаны анализы BSA SEC-MALS с использованием столбца исключения размера поры 200 Angstrom. Следы хроматограммы нормализуются до пика мономера и компенсируются для ясности. Общие артефакты, которые могут быть проигнорированы, указываются, в том числе пик частиц в начале сигнала рассеяния света, а также соли и растворенных пиков воздуха вблизи общего объема пронизывания в сигнале рефракционного индекса.
Хроматограмма демонстрирует отличное разделение мономера-димера-тримера, а светоразбрасывной сигнал демонстрирует высокий сигнал к шуму. Мономерные и более тусклые средние значения молярной массы демонстрируют высокую однородность. Вот примеры низкого качества анализа SEC-MALS.
В этом примере неадекватное разделение на столбце исключения размера поры 75 Ангстрем приводит к пику частиц от восьми до девяти минут, что не очень хорошо отделено от белков. Здесь существует неадекватное отношение сигнала к шуму, и обширные частицы, прилегающие к белкам, очевидны в сигнале рассеяния света. Ключами к хорошим результатам SEC-MALS являются выбор соответствующей колонки, обеспечение калибровки системы с низким уровнем освещенности, а также предварительная фильтрация или центрифугирование образцов для удаления частиц.
После SEC-MALS, образцы протеина можно более далее проанализировать для связывая сродства, bioliza, резонанса плазмона поверхности, isothermal кальциметрии titration, биолеридной phorometry, микромасштабного термофореза, или градиента состава, multi-angle рассеяния света. Структура белка может быть определена с помощью рентгеновской кристаллографии, криоэлектронной микроскопии или ЯМР.
