Ранее мы разработали устройство для применения механического напряжения к клеткам-адептам. В текущей работе мы переработали геометрию субстрата и настроили настройку для визуализации этих клеток штамма с высоким разрешением. Основным преимуществом этой клеточной системы является то, что она обеспечивает субклеточную визуализацию с высоким разрешением в 100x клеток деформации.
Демонстрацией изготовления субстрата будет Вики, научный сотрудник из моей лаборатории. Начните с разработки одной хорошо полидиметилсилоксана плесень, следуя вместе в сопроводительном текстовом протоколе. Затем смешайте 20 частей полидиметилсилоксана базы с одной частью лечебного средства в одноразовой чашке.
После смешивания, место polydimethylsiloxane смесь в вакууме де-газсер на 0,8 бар в течение 30 минут, чтобы удалить пузырьки из смеси. Затем, залить полинемиметилсилоксан смесь в форму и блюдо. Удалите любые дополнительные пузырьки на данном этапе, де-газирования его снова на 0,8 бар вакуума в течение 30 минут.
Когда де-газирование завершено, испечь образцы при температуре 80 градусов по Цельсию на выравнивающий стол в течение двух часов. Затем аккуратно удалите образцы из духовки и дайте им остыть до комнатной температуры. Вырезать края с лезвием и аккуратно очистить вылечить полидиметилсилоксан.
На 150-миллиметровом диаметре полидиметилсилоксана нарисуйте двухсантиметровую сетку маркером. В пределах каждого квадрата, сделать один сантиметр на один сантиметр квадрата, оставляя маржу 0,5 сантиметра со всех сторон. Используйте лезвие, чтобы тщательно разрезать вдоль линий и получить квадратные отсеки.
Затем очистите образцы, инкубируя их в 100%ацетон в течение четырех часов, 100% этанола в течение еще четырех часов, а затем в автоклавной воде в течение четырех часов. Поместите очищенные образцы на парафиновую пленку в пластиковую тарелку диаметром 150 миллиметров и высушите образец в духовке по Цельсию на 80 градусов в течение четырех часов. После завершения, печать блюда с парафиновой пленкой и хранить их в холодной комнате до дальнейшего использования.
Подготовь клетки-предшественники и приостановите их в среде распространения. Семя этих клеток при плотности 35000 клеток на квадратный сантиметр на PDL покрытием пластиковых поверхностей. Отрегулируйте объем среды пролиферации до трех миллилитров на десять сантиметров в квадрате площади поверхности.
Более низкий объем средств массовой информации может привести к слипанию клеток, возникающих из поверхностных сил напряжения, в то время как больший объем средств массовой информации в блюдах может привести к утечке средств массовой информации. На третий день после посева, урожай клеток и считать их с помощью гемоцитометра. Затем семя 35 000 клеток на полидиметилсилоксановую пластину с 700 микролитров среды пролиферации.
Затем добавьте плазминическую конструкцию для маркировки комплексов H2B-гистона клетки зеленым флуоресцентным белком, следуя инструкциям производителя. Через 24 часа, смонтировать образцы полидиметилсилоксана с клетками, которые будут растягиваться на одноосном устройстве деформации. Затем измените среду во всех образцах на среду дифференциации.
Измерьте разтянутую длину клеточного отсека и поверните винт микрометра этапа для того чтобы увеличить длину отсека клетки пожеланным количеством напряжения. Оставьте растянутые и ненатянутые образцы поликиметилсилоксана в инкубаторе при 37 градусах по Цельсию до визуализации. Подготовь микроскоп инкубатор для живой визуализации, установив температуру инкубатора до 37 градусов по Цельсию.
Далее, довести 100x цель погружения нефти в центральное положение, так как объективный поворот не будет доступен позже. Оказавшись в положении, отвинтить цель и винт его обратно вместе с объективным кольцом, так что цель может быть ближе к клеткам. Затем добавьте каплю масла к цели.
Используя отпечатанный на заказ держатель, покрывайте держатель вакуумной смазкой на периферии окна и поместите стеклянную крышку нулевой толщины на верхнюю поверхность держателя. Лента пластиковое окно на сцену микроскопа. Затем завинчивай стадию перевода на сцену микроскопа и перемести ее в топ-самое положение.
Удалите 500 микролитров среды из растянутой полидиметилсилоксана пластины, которые будут изображены, и добавить эту среду на стеклянную крышку в белом пластиковом окне. Затем используйте пару стерильных пинцетов, чтобы тщательно отделить квадратный отсек от полидиметилсилоксана пластины. Держите устройство деформации в вертикальном положении, так что клетки сталкиваются вверх, над белым пластиковым окном и тщательно инвертировать устройство деформации, с тем чтобы любой дополнительный средний падение непосредственно в середине стеклянной крышки с клетками лицом вниз.
Поместите нижнюю часть устройства деформации на сцену перевода, используя двустороннюю ленту, чтобы удерживать ее на месте. Глядя через окуляр под ярким полем, очень медленно принести напряжение устройства вниз и переместить цель до сосредоточиться на клетках. Выполните этот фокусный шаг медленно, чередуясь между снижением стадии перевода и повышением цели.
Если стадия перевода й снижается слишком сильно, клетки могут сжиматься и, следовательно, умирать. Если мы поднимем цель слишком высоко, это может сломать стеклянную крышку и привести к утечке среды. Сканирование полидиметилсилоксана пластины в X и Y направлениях, чтобы найти клетку, которая имеет флуоресцентное ядро, используя эпифлоресценцию на 488 нанометров возбуждения.
Также убедитесь, что клетка имеет соответствующую морфологию при взгляде на образец под ярким полем. Запись широкой поля или открытой скважины изображения ядра с 488 нанометров волнового возбуждения и клетки с ярким полем возбуждения на 30-секундных интервалов на кадр в общей продолжительности не менее 30 минут. Переработанная геометрия поликометилсилоксанового субстрата и настройка изображения, показанная на этом видео, минимизируют расстояние между клетками и целью.
Это позволяет вовремя изображения флуоресцентно помеченных ядер клеток с использованием 100x цели погружения масла. Чтобы измерить ядерные колебания, сначала замойьте ядерную область по сравнению со временем. Затем обвядйте данные с помощью полиномиального третьего порядка.
И, наконец, участок остаточных колебаний и рассчитать стандартное отклонение остаточных колебаний. Ядерные колебания клеток-предшественников олигодендроцитов, после химической индукции дифференциации с и без 10%-ного штамма, показывают, что только при химической индукции амплитуда ядерных колебаний показала значительное снижение на 48 часов, но не в 24 часа. С другой стороны, химическая индукция вместе с 10%-ным напряжением показала значительное снижение в течение 24 часов, которое оставалось неизменным без дальнейшего сокращения на 48 часов.
Самое главное помнить, что рабочая дистанция выбранной цели должна быть равна или больше глубины клеточного отсека плюс толщина крышки. Субстрат может быть переработан, чтобы включить сетку, которая облегчила бы визуализацию одной и той же ячейки до и после применения штамма, так как до и после типа набора данных уменьшает шум, поступающий от экспериментальной ошибки. Используя эту установку изображений, многие субклеточные явления в живых клетках приверженцев, такие как локализация белка или динамика клеточных компонентов, могут быть изображены в течение нескольких секунд после применения механического напряжения.
