Ключевой вопрос, который мы хотим решить с помощью этого метода, заключается в том, как мы можем использовать образцы РНК из материала, приобретенного на местных продовольственных рынках для клонирования биотехнологических соответствующих генов? Здесь мы используем тихоокеанских устриц в качестве примера для демонстрации этого подхода и потенциального дальнейшего применения. Основным преимуществом этого метода является то, что обычное секвенирование генома или кДНК образцов устриц можно обойти.
Вместо этого, последовательности цитохрома c oxidase подразделения I и NADH дегидрогеназы были сопоставлены с общедоступными эталонными последовательностями из тихоокеанских устриц, чтобы выбрать наиболее тесно связанный образец. КДНК, подготовленная из этого образца, может быть непосредственно использована для клонирования биотехнологических релевантных генов, которые могут быть отобраны с использованием общедоступной информации о последовательности. Демонстрация процедуры будет Yongmei Lyu и Yuquan Ли, два аспиранта из гликомики и Гликан биоинженерии научно-исследовательский центр в Нанкинском сельскохозяйственном университете.
Чтобы подготовить образец ткани устрицы, используйте стерилизованный скальпель, чтобы вырезать около 100 миллиграммов однородной мягкой ткани из приблизительного геометрического центра каждого образца устрицы. Перенесите образец в раствор, наполненный 50 миллилитров жидкого азота. Измельчить флэш-замороженной ткани устрицы в мелкий порошок.
Взвесить 75 миллиграммов замороженной ткани каждого образца в стерильную 1,5-миллилитровую центрифугу и смешать с одним миллилитром реагента гуанидина тиоцианат-фенола. Наиболее важным шагом этой процедуры является этап извлечения РНК. Для того, чтобы свести к минимуму деградацию РНК, необходимо сократить время между сбором ткани устрицы и экстракции РНК.
Центрифуга образца на 14000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение 15 минут. Перенесите супернатант в новую 1,5-миллилитровую центрифугу, добавьте 200 микролитров хлороформа и тщательно перемешайте на вихревом миксере в течение 10-15 секунд, пока смесь не станет молочно-белой. Далее центрифуга в течение 15 минут, как это было сделано ранее.
С помощью 200-микролитровой пипетки тщательно перенесите верхний аковый слой, не нарушая межфазы, в новую 1,5-миллилитровую центрифугу. Добавьте 500 микролитров изопропилового спирта в центрифугу и аккуратно переверните для смешивания образцов. Затем оставьте образцы на льду на 20 минут.
Центрифуга при 14 000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение восьми минут, и удалить супернатант. Повторное потребление гранул в один миллилитр 75% этанола, и центрифуга на 14000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут. Удалите все супернатанты, и повторить мыть в этаноле.
Высушите гранулы в течение шести минут при комнатной температуре. Затем растворите высушенные гранулы РНК в 25 микролитров воды, обработанной DEPC, и держите трубку на льду. Используйте образцы РНК в течение 24 часов.
Для создания библиотеки cDNA сначала подготовьте реакционной смеси для каждого образца РНК в 300-микролитровой трубке ПЦР, добавив решения в соответствии с рукописью. Добавьте в трубку один микролитер извлеченного образца РНК. Инкубировать смесь в ПЦР термоциклер в течение 60 минут при температуре 42 градусов по Цельсию, а затем увеличить температуру до 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут.
Храните сгенерированную библиотеку cDNA до 12 месяцев при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Во-первых, добавьте один микролитр генерируемой библиотеки cDNA в трубки, содержащие смеси ПЦР, подготовленные в соответствии с рукописью. Поместите трубки ПЦР в термоциклер ПЦР и выполните усиление ПЦР с первоначальным шагом денатурации и 35 циклами реакции ПЦР, состоящими из шага анны, шага удлинения и шага денатурации в соответствии с рукописью.
После циклов выполните один заключительный шаг удлиниации в течение пяти минут. Используйте пять микролитров продукта ПЦР для проверки качества электрофорезом агарозного геля. Наблюдайте усиленный ген COX1 или ND в качестве одной полосы на уровне 759 или 748 базовых пар, соответственно.
Чтобы очистить остальную часть продукта ПЦР, добавьте в каждый образец 100 микролитров ДНК-связывающего буфера, содержащего высокие концентрации чаотропных солей. Vortex кратко смешать содержимое. Поместите столбец очистки в двухми миллилитровую центрифугу.
Пипетт реакционной смеси в колонку. Поместите трубку с установленной колонкой в центрифугу при температуре 14 000 раз г в течение одной минуты при комнатной температуре. После отбрасывания фильтрата из двухмилилитровой центрифуги трубки, мыть два раза с 700 и 400 микролитров стирального раствора W2 путем центрифугирования при 14000 раз г.
Затем нагрейте один миллилитр деионизированной воды до 65 градусов по Цельсию в металлическом блоке нагревателя. Перенесите колонку в новую 1,5-миллилитровую центрифугу и пипетку 25 микролитров разогретой деионизированной воды в центр мембраны белой колонны. Пусть мембрана замочить в течение одной минуты при комнатной температуре.
Затем центрифуга трубки с колонкой в 14 000 раз г в течение одной минуты при комнатной температуре. Откажитесь от столбца и храните очищенный продукт ПЦР до 12 месяцев при температуре минус 20 градусов по Цельсию. По желанию, COX1 или ND обратные грунтовки также могут быть использованы для двунаправленного последовательности.
Для последовательности Sanger используйте соответствующую форвардную грунтову COX1 или ND. После получения результатов секвенирования сравните последовательности с последовательностью генома тихоокеанского штамма ссылки устриц с помощью онлайн-инструмента NCBI Nucleotide BLAST. Используйте соответствующие форвардные и обратные грунтовки генов MgUGD и MgUXS для усиления и очистки ПЦР, как это было сделано ранее.
После инкубации очищенных продуктов ПЦР с буфером пищеварения, подготовить предварительно вываренный вектор pET-30a путем растворения 500 нанограммов pET-30a в 1,5-миллилитровой центрифуге трубки, и добавить деионизированной воды для пополнить до 16 микролитров. Затем добавьте в трубку два микролитера 10-времени концентрированного буфера пищеварения и по одному микролитеру, каждый из 20 единиц ограничения эндонуклейсов Nde1 и Xho1. Инкубировать смесь при 37 градусах по Цельсию в течение трех часов.
После этого добавьте один микролитер из одноточьей щелочной фосфатазы и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение дополнительного часа. Затем поместите трубку в разогретый металлический блок нагреватель при 75 градусах по Цельсию в течение 10 минут, чтобы инактивировать щелочной фосфатазы. После культивирования клеток E.coli BL21 с генами MgUGD и MgUXS, перенесите культуру в 400-миллилитровую LB-среду в двухлитровой колбе и поместите ее на шейкер при температуре 200 об/мин при температуре 37 градусов по Цельсию.
Через три часа проверьте оптическую плотность на фотометре на длине волны 600 нанометров и убедитесь, что она достигает поглощения примерно 0,5. Затем уменьшите температуру шейкера до 20 градусов по Цельсию. Добавьте 400 микролитров одномядерного IPTG, чтобы вызвать экспрессию рекомбинантных белков в течение трех часов.
После сбора клеток, нарушить клетки sonication в течение 20 минут при четырех градусах по Цельсию. Центрифуга при 14 000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение 20 минут, и собирать супернатант в новую трубку для теста активности. После анализа активности, утолить реакции, добавив 20 микролитров метанола и 40 микролитров хлороформа в смеси MgUXS и MgUGD.
Вихрь образцовых смесей и центрифуг при 14 000 раз г в течение шести минут и четырех градусов по Цельсию. Соберите верхний aqueous слой каждой пробки в новых пробках для масс-спектрометрии MALDI-TOF. В этом эксперименте последовательное выравнивание последовательности последовательностей генов COX1 и ND сильно расходящихся образцов сравнивались со эталонным тихоокеанским штаммом устриц.
Красные стрелки показывают нуклеотидные различия между эталонной последовательностью и последовательностью полученных образцов кДНК. Последовательности генов COX1 и ND близко родственного образца устрицы показывают низкое расхождение со эталоном тихоокеанского штамма устриц. Масс-спектрометрия MALDI-TOF показывает успешное применение библиотеки cDNA для клонирования промышленно релевантных генов MgUGD и MgUXS.
Гель изображение также определяет UDP-глюкуроновой кислоты и UDP-ксилоза, порожденных энзиматический действие последовательно выраженных и очищенных MgUGD и MgUXS. Этот метод не требует идеального матча между эталонной последовательностью и полученными последовательностями маркеров и должен дать исследователю уверенность в работе с неучтенными устрицами. В принципе, этот метод может быть применен к любому неучтенного биологического образца, для которого в доступе находятся последовательности из тесно связанных справочных видов.
Этот метод позволяет неэкспертным исследователям легко получить доступ к генетическому материалу потенциального биологического значения и открывает путь для большего времени ученых для работы с легкодоступными, но неполно идентифицированными биологическими образцами.
