Этот протокол позволяет визуализировать вирусную инфекцию и обеспечивает глубокое понимание спатиотемпорального разрешения инфекционной среды и окружающего ее клеточного контекста. Применение иммуностента к глубокой визуализации тканей не только позволяет обнаруживать вирусы, но и фактически позволяет дифференцировать различные клеточные субпопуляции с использованием соответствующих клеточных маркеров. Чтобы исправить ткани для иммуностимплеинга место образцов мозга в один к 10 отношение 4%paraformaldehyde в PBS для образца объема ткани, по крайней мере 48 часов при четырех градусах по Цельсию.
В конце периода фиксации мыть образцы тканей три раза в PBS, по крайней мере 30 минут за стирку перед передачей образцов 02% азида натрия в PBS при четырех градусах по Цельсию. Затем используйте вибром, установленный на 0,3-0,5 миллиметра в секунду, чтобы разрезать ткани на одномиллиметровые толстые секции. Храните секции в свежем 02%натрия азида в PBS при четырех градусах по Цельсию.
Для предварительной обработки метанола погрузите образцы в восходящую серию метанола, как указано в течение одного часа на инкубацию при комнатной температуре с нежными колебаниями. После последней инкубации охладить образцы до четырех градусов по Цельсию. Замените 100%-ный метанол четырьмя миллилитров предварительно охлажденного раствора отбеливания для ночной инкубации при четырех градусах Цельсия.
На следующее утро заменить отбеливающий раствор четырьмя миллилитров свежего 80%метанола в течение одного часа инкубации при комнатной температуре. Затем погрузите образцы в нисходящую серию метанола в обратном направлении того, что только что было продемонстрировано, мыть образцы один раз в течение одного часа в четырех миллилитров PBS после 20%метанола погружения. Для иммуностимулирования секций тканей головного мозга мыть образцы два раза в течение одного часа в четырех миллилитров 0,2%Triton X-100 в PBS, а затем пермяки в течение двух дней при 37 градусов по Цельсию в четырех миллилитров 0,2%Triton X-100, 20%dimethyl sulfoxide, и 0,3 моларглицина в PBS.
Блокируйте любые неспецифические связывания с четырьмя миллилитров 0,2%Triton X-100, 10%dimethyl sulfoxide, и 6%нормальной сыворотки в PBS в течение двух дней при 37 градусах по Цельсию. В конце блокирующей инкубационой этикетки образцы с двумя миллилитров первичного раствора антитела в течение пяти дней при 37 градусах по Цельсию, освежая раствор антитела через два и 1/2 дня. Далее, мыть образцы в течение одного дня в четырех миллилитров 0,2%Tween 20 и 10 микрограмм на миллилитр гепарин в PBS обмена мыть буфера по крайней мере четыре-пять раз в течение дня и оставив окончательный мыть на ночь.
На следующий день инкубировать образцы в двух миллилитров вторичного раствора антител в течение пяти дней при 37 градусах по Цельсию. Затем мыть образцы в четырех миллилитров свежих 0,2%Tween 20 и 10 микрограммов на миллилитр гепарина в PBS, как попродемонстрировано. Для ядерного окрашивания образцов инкубируют образцы в четырех миллилитров нуклеиновой кислоты пятна TO-PRO-3 в течение пяти часов защищены от света.
В конце инкубации мыть образцы в 0,2%Tween 20 и 10 микрограммов на миллилитр гепарина в PBS, как попродемонстрировано, а затем обезвоживание в восходящей терт-бутанол серии в течение двух часов за погружение. После 90%погружения перенесите образцы на 96%tert-butanol раствор на ночь. На следующее утро, обезвоживать образцы дальше в 100% терт-бутанол в течение двух часов, прежде чем очистить ткани разделов в свежеприготовленных BABB-D15 в течение двух-шести часов, пока они не оптически прозрачны.
Образцы могут храниться в BABB-D15, защищенном от света, до их монтажа и визуализации. Для монтажа образцов используйте 3D-принтер для печати камеры изображений и крышки. Намонтировать крышку диаметром 30 миллиметров на камеру визуализации с однокомпонентной комнатной температурой, вулканизирующей силиконовую резину.
Аналогичным образом, смонтировать 22-миллиметровый крышку на крышку. Используйте водяной ватный тампон, чтобы удалить избыток силиконовой резины на обоих кольцах, прежде чем позволить резине вылечить на ночь. На следующий день поместите образец в камеру визуализации и добавьте небольшой объем BABB-D15 в камеру перед вставкой крышки.
Использование подкожной иглы заполнить камеру с BABB-D15 через вход и подключить вход перед уплотнением камеры изображений с силиконовой резины. Для настройки изображения выберите соответствующие лазерные линии для используемых флюорофоров и отрегулируйте диапазоны обнаружения каждого детектора, чтобы предотвратить перекрытие сигнала между каналами. Затем установите параметры приобретения, чтобы найти верхнюю и нижнюю границу стека и приобрести стек изображений.
Для генерации 3D-проекций стека изображений откройте файлы изображений на Фиджи и выберите инструмент Image Color Channels Tool More и Split Channels, чтобы разделить объединенные изображения на отдельные каналы. Для коррекции отбеливателя изображений, для каждого канала выберите Коррекция отбеливателя изображения и выберите простое соотношение. Используйте ползунки, чтобы настроить яркость и контрастность для каждого канала, а также выбрать цвет изображения и слияние каналов.
Отметьте опцию Создайте композитный. Преобразуйте изображение в формат RGB и выберите Стеки изображений и 3D-проект для создания 3D-проекции. Выберите Brightest Point в качестве метода проекции и установите интервал между ломтиками, чтобы соответствовать размеру приобретенного стека изображений.
Для максимального качества установите приращение угла вращения до одного и включите Интерполацию. При необходимости измените общую ротацию, пороговые значения прозрачности и непрозрачность. Затем сохраните 3D-проекцию как форматы файлов tiff и AVI.
С помощью иммуностентинга вируса бешенства фосфопротеин сложные слои инфицированных нейрональных клеток можно визуализировать в толстых участках образцов тканей мозга мыши. Впоследствии можно реконструировать бесшовные 3D-проекции приобретенных стеков изображений. Из-за высокого разрешения, с которым изображения стеки приобретаются, инфекция может быть оценена до одного уровня клеток, что позволяет утверждения о, например, обилие и распределение антигена в ячейке интересов.
В дополнение к ткани мозга мыши, протокол может быть применен к образцам тканей мозга от других видов животных. Например, участки, полученные из различных отсеков мозга инфицированного хорька, показывают различную степень заражения вирусом бешенства. Астроциты могут быть дифференцированы через выражение белка глиальной фибриллярной кислоты в то время как невриты могут быть специально окрашены для микротрубочек связанных белка II.Simultaneously, вирусные белки могут быть совместно окрашены для оценки взаимосвязи между инфицированными клетками и подчеркнул клеточной субпопуляции.
Для иммуностимтинга выбор антител для обнаружения белков, представляющих интерес имеет решающее значение. Хотя стандартные концентрации иммуногистохимии часто являются хорошей отправной точкой, некоторые антитела могут нуждаться в дополнительной корректировке. Многие химические вещества, используемые в этом протоколе, имеют вредные свойства.
Проведи соответствующий эксперимент в дымовом капюшоне, надев соответствующее средства индивидуальной защиты, включая лабораторное пальто и перчатки.
