Этот протокол помогает нам определить, как изменения в местной биомеханики, архитектуре тканей, паракринной среде и джукстакриновых взаимодействиях влияют на клеточный фенотип. Этот метод позволяет нам исследовать классические парадигмы и экспериментальную эмбриологию, не вызывая масштабных оскорблений тканей, которые обычно возникают в традиционных графинговых экспериментах. Чтобы найти правильное давление для инъекций, полезно начать с более низкого давления инъекций и увеличиваться постепенно, пока не будет достигнут устойчивый поток клеток.
Визуализация этого метода помогает в достижении прямого понимания того, как инъекционное оборудование должно быть расположено по отношению к ткани-мишени. Демонстрацией процедуры будут два члена моей лаборатории, Тревор Хенли и Кэндис Томас. За 24 часа до имплантации потяните стеклянные капилляры на шкив микропипта в соответствии со стандартными протоколами и окуните капилляры в силиконизирующий агент, чтобы покрыть внешние поверхности игл.
Далее загрузите от 5 до 10 микролитров силиконизирующего агента в наконечник пипетки микроинъекции и поместите наконечник в широкий конец одного внешне покрытого вытянутого стеклянного капилляра. Распоитите наконечник пипетки как можно ближе к кончику стеклянной иглы и выбросит силиконизирующий агент, медленно убирая погрузочную пипетку, чтобы свести к минимуму пузырьки воздуха внутри иглы. Оставьте силиконизирующий агент в стеклянной игле на 10 минут, прежде чем использовать новую погрузочную пипетку для аспирации раствора.
Затем высушите иглы в дымовой капот на ночь. Для подготовки эмбриона хозяина, инкубировать плодородные куриные яйца в горизонтальной ориентации во влажном инкубаторе при 38 градусах по Цельсию и использовать угловые типсы, чтобы сделать более одного миллиметра диаметром прокола в нижней части плоского конца каждого яйца вдоль экватора яйца. Вставьте 18 калибровочных игл, прикрепленных к 10 миллилитров шприц в прокол, чтобы удалить около пяти миллилитров альбумена.
И нанесите прозрачную ленту на верхнюю часть яичной скорлупы. Оценка лентой области вдоль верхней части яйца с угловой типсов и использовать изогнутые ножницы тенотомии сократить примерно 2,5 сантиметра окна в лентой разделе яйца. Осмотрите и уровень эмбриона на основе критериев, установленных Гамбургером и Гамильтоном, и используйте одномиллиметровый шприц, оснащенный иглой калибра 32, чтобы ввести около 200 микролитров от одного до пяти разбавления индийских чернил в HBSS под эмбрионом.
Затем запечатайте прокол прозрачной лентой и добавьте один миллилитр HBSS drop-wise на эмбриональный диск, прежде чем запечатать оконную оболочку парафиновой пленкой для размещения яйца обратно во влажный инкубатор. Когда эмбрионы достигнут стадии Гамбургер и Гамильтон 19, промойте силиконовые стеклянные капилляры с деионизированной водой и дайте капиллярам высохнуть в течение трех-четырех часов при комнатной температуре. В то же время, передача эмбриона из одного яйца в 100 на 15 миллиметров Петри блюдо, содержащее стерильную комнатную температуру HBSS и поместить блюдо под стерео микроскопом.
Используя миппы, тенотомию ножницами и микро шпателем, изолируйте все эмбриональное сердце от эмбриона и изолируйте атрию от сердца. Поместите предсердную ткань в стерильную микроцентрифугную трубку 1,5 миллилитра, содержащую один миллилитр HBSS на льду. Когда все донорские ткани были собраны, гранулы тканей центрифугации в фиксированной угловой микроцентрифуг.
Для пищеварения донорской ткани повторно приостанавливайте гранулы в одном миллилитре предварительно разогретого 05%трипсина ЭДТА в течение 15 минут инкубации в трясущимся тепловом блоке при 300 вращениях в минуту. В конце инкубации, пипетка пищеварения раствор несколько раз, чтобы разбить все оставшиеся ткани и гранулы сердечной лизации центрифугации. Повторно приостанавливайте гранулы в одном миллилитре трипсина, нейтрализуя раствор для другой центрифугации с последующим повторной подвеской в 400 микролитров красного флуоресцентного раствора красителя.
Через 20 минут при 37 градусах Цельсия гранулы клеток центрифугированием для одного-трех моет в одном миллилитре HBSS за стирку. Затем повторно приостанавливать помеченные клетки в пять раз десять-четвертые клетки на концентрацию микролитора в свежем HBSS. Для инъекции виво донорских клеток, backload клеточной подвески в сухой, силиконовой обработанной стеклянной капиллярной пипетки, как попродемонстрировано, и смонтировать пипетку в аппарат микроинъектора давления.
Передача каждого эмбриона-хозяина, который будет введен из увлажняемого инкубатора в держатель яйцеклетки под флуоресцентным стерео рассечением микроскопа. И использовать стерильные тонкие типсы, чтобы открыть вителлиновую мембрану. Сделайте разрез на 5-1 миллиметр в перикардии и распоимите микроинъектер таким образом, чтобы кончик микроинъекции иглы проникал в ткани-мишени.
Установите микроинжектор для применения одиночных импульсов продолжительностью 5 секунд и в диапазоне от 100 до 400 гектопаскалей в давлении. И давление-инъекции клеток. Очень важно проверить успешную имплантацию клеток путем визуализации флуоресцентного сигнала до повторного пропечатки яйцеклетки.
Эмбрион также можно сфотографировать, чтобы задокументировать эту процедуру. Когда все клетки были введены, втягивать микроинжектор аппарата и удалить яйцо из держателя. Затем добавьте один миллилитр теплого HBSS капли мудрым на эмбрион.
Печать яйцо с прозрачной упаковочной лентой и вернуть яйцо во влажный инкубатор в течение 24 часов после имплантации. Здесь показаны сердце и окружающие ткани эмбрионального сердца хозяина после имплантации донорских предсердий миоцитов. В этом репрезентативном эксперименте донорские клетки были микроинъектированы в проэпикардий эмбриона хозяина аналогичной стадии.
Оптическое сечение с помощью конфокального микроскопа показало, что единственными положительными клетками сердечного мышечного маркера в проэпикарде были фокусно имплантированные флуоресцентные красные положительные клетки. Позаботьтесь, чтобы не чрезмерно манипулировать эмбриона получателя, как разрывы в сердце и местной сосудов, вызванных инъекционной иглой может привести к снижению жизнеспособности. После этой процедуры, различные анализы вниз по течению могут быть выполнены, в том числе иммуногистохимии, на месте гибридизации и сортировки клеток.
Силиконизирующий агент чрезвычайно легковоспламеняющийся и остро токсичный. Она всегда должна быть обработана с осторожностью и надлежащей личной защиты оборудования внутри дыма капот.
