Эта модель мукозита, вызванного химиотерапией, может быть использована для определения важных конечных точек и пролиферированных маркеров мелких кишечных повреждений и компенсационной гиперраспространяемости у мышей. Этот метод является эффективным по времени и экономически эффективным и простым в проведении. С помощью такого стандартизированного метода легче сравнивать аналитические конечные точки с несколькими вариациями.
Для индукции 5-флораурацила или 5FU мукозита загрузите 1 миллилитровый шприц, оснащенный 27 калибром на 19 миллиметровую иглу с соответствующим объемом 5FU и вручную удерживайте мышь-реципиент. Поддерживая мышь в твердом, но нежном захвате, подвергайте брюшной стороне животного и вставьте иглу в внутрипаритонную полость в пределах одного из нижних квадрантов живота. Затем, аспират для обеспечения надлежащего размещения иглы и вводить 5FU.
В соответствующей экспериментальной конечной точке, 4-Бромо-деоксюридин или BrdU количественной оценки, весят 5FU раненых животных мыши и доставить 5 миллиграммов на килограмм BrdU путем внутриперитонеальной инъекции в дым капот. Через 150 минут после injetion BrdU, подтвердить отсутствие реакции на щепотку ноша, записать вес обезболивающей мыши, и поместить животное в положение на спине. Выполните лапаротомию, чтобы разоблачить брюшную полость и сделать разрез грудной полости, чтобы ввести пневмоторакс.
Вырезать выше пилора, и тщательно извлечь втягивать кишечной ткани от животного, пока cecum не будет достигнута. Используя типсы, осторожно зажим проксимального люмена закрыты и использовать 10 миллилитров шприц оснащен 25 калибровочной иглы, чтобы промыть тонкий кишечник с солевым раствором. Затем поместите опорожненный кишечник на чистую бумагу для тщательного удаления избыточного раствора соли.
Для сбора тканей, урожай тонкой кишки из инъекционных животных, как только что продемонстрировали и записывать вес промытой ткани. После гистологической обработки, ткань может быть изображена под 10x целью светового микроскопа, подключенного к камере, чтобы получить гистологические фотографии собранных тканей. Для измерения площади иммунореактивных клеток BrdU откройте изображение, представляющие интерес для изображения J, и откройте изображение микрометра сцены.
Используйте инструмент выбора прямой линии, чтобы нарисовать прямую линию на изображении микрометра, чтобы определить известное расстояние и выбрать набор масштаба в меню анализа. Введите значение в известном поле расстояния и определите единицу длины в блоке длины коробки. Откройте изображение, интересное для измерения площади иммунореактивных клеток BrdU на склеп, и установите цветовую графику до 8-битной под меню типа изображения.
Увеличьте контраст изображения при контрасте, усиленном процессом, и установите насыщенные пиксели до 0,4%Нанесите порог на изображение, чтобы сегментировать иммунопозитивность и настроить изображение. Выберите пороговый и красный, перемещая пороговую планку, чтобы выбрать порог от 10 до 20 процентов. Затем выберите хорошо ориентированный склеп и используйте инструмент для выбора от руки, чтобы отметить область вокруг него.
Чтобы измерить пороговую область, откройте вкладку анализа и выберите анализ частиц. В окне анализа частиц установите размер до 20 до бесконечности и нажмите на единицы пикселей коробки. Установите круговорот до нуля к одному и установите шоу на контуры.
Затем нажмите на результаты отображения, обобщайте и включите коробки отверстий. Результаты измерений будут отображаться в сводном окне. Чтобы измерить глубину склепа, откройте изображение в Дзен-Свете и подключись к камере.
Сделайе снимки в режиме камеры с целью 20x, и переключитесь в режим обработки, чтобы открыть снимок. Переключитесь на представление измерения. Используйте линейный инструмент, чтобы начать линию в нижней части хорошо ориентированного склепа, заканчивая линию в верхней части склепа.
Затем экспорт измерений и рассчитать среднее глубина склепа и заполнить в качестве высоты. Вес тонкой кишки уменьшается со дня 2 до 4 дня, что свидетельствует о потере массы энтероцитов. Следует отметить, что к 5-му дню вес не значительно отличается от веса дня 0 на обработанных животных.
Измеренное распространение путем включения BrdU почти отменено в дни 1 и 2, но в дни 4 и 5, приблизительно 4-и 5-кратное увеличение в их распространении, соответственно. Это гиперпролив также наблюдается при измерении глубины склепа. В регенеративной фазе мукозита существует сильная корреляция между включением BrdU и глубиной склепа, которая не наблюдается во время острой фазы, предполагая, что использование глубины склепа в качестве конечной точки может быть подходящим в острой фазе мукозита.
Трансгенные мыши, с недостаточной Секреции L-клеток, демонстрируют значительную потерю массы тела и снижение веса тонкой кишки в фазе восстановления, по сравнению с тем, что наблюдается в диких мышей типа 5-FU. Кроме того, трансгенные мыши не проявляют компенсационной гиперпроливности, так как склепы значительно короче, чем у мышей дикого типа и здорового контроля. При попытке этой процедуры, убедитесь, что очистить тонкий кишечник полностью, и удалить избыток солевого раствора перед взвешиванием ткани, чтобы получить небольшой вес кишечника только.
После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как вести, собирать, и определить важные конечные точки небольшой кишечной травмы. И эффективно получать воспроизводимые данные. Не забывайте, что работа с химическими соединениями, такими как 5FU и BrdU может быть опасным, и что меры предосторожности, такие как использование лабораторного пальто, перчатки, и дым капот всегда должны быть приняты при выполнении этих процедур.
