Общей целью этого протокола является предоставление нам электромикроскопического разрешения распределения воды в различных видах ксилемовых клеток на месте. Этот метод использовался для наблюдения за водой в ксилеме в целях уточнения распределения воды и изменения водных режимов, сезонных колебаний распределения воды, последствий циклов замораживания/оттепели, распределения воды во влажной древесине и кавитации, вызванной определенными биотическими стрессами. Замораживание-фиксация живого ствола при высоких гидравлических напряжениях иногда вызывает искусственные кавитации, которые наблюдаются крио-SEM как разорванные кристаллы льда в люмене трубопровода.
Эта обновленная процедура фокусируется на получении высококачественных аэротомных микрографов ксилема без артефакта в процедуре отбора проб. Жизнеспособная демонстрация имеет решающее значение, поскольку существует ряд важных деталей, которые не могут быть легко объяснены. В то же время, получить обучение не легко, потому что только несколько лабораторий по всему миру практикуют этот метод.
Чтобы начать эту процедуру, приложите ветку и листья для отбора проб с черным полиэтиленовым пакетом, чтобы уравночные потенциал воды между ксилемом и листьями более чем за два часа до отбора проб. Используя камеру давления, определите водный потенциал по крайней мере двух листьев из образца. Когда потенциал воды выше, чем примерно минус 0,5 мегапаскаля, образец может быть собран после замораживания.
Когда потенциал воды ниже минус 0,5 мегапаскаля, приступить к лечению для релаксации. Зафиксните водонепроницаемый воротник вокруг стебля, который будет наполнен водой. Используя обрезку ножниц или пилы, вырежьте стебель под поверхностью воды и держите разрезанную часть образца под водой.
Перенесите образец в другой контейнер с водой как можно быстрее, чтобы свести к минимуму воздействие разреза в воздух. Для широколивных видов убедитесь, что длина от места, где крио образец для SEM будет получен к краю разреза собранного стебля больше, чем максимальная длина сосуда образца, с тем чтобы предотвратить напряженность индуцированных артефактов в кризампле. Затем накройте образец черным полиэтиленовым пакетом, чтобы уменьшить транспирацию.
Держите разрезанный конец образца в воде и поддерживать это состояние в течение примерно 30 минут, чтобы расслабиться ксилем напряженности. После этого, измерить потенциал воды снова, чтобы подтвердить расслабление ксилема напряженности. Во-первых, используйте ножницы или полезный нож, чтобы вырезать и открыть одну сторону водонепроницаемого воротника.
Прикрепите воротник плотно вокруг стебля клейкой лентой, удерживая диафрагму горизонтально. Наложить изоляционные перчатки и безопасно держать сосуд жидкого азота. Выполнить жидкий азот в воротник, пока он не полон и держать его заполнены постоянно добавляя дополнительный жидкий азот, чтобы полностью заморозить воду в ксилеме.
После достаточного времени замораживания, отделить воротник от замороженной части образца стебля для того, чтобы удалить жидкий азот. Немедленно используйте тонкую ручную пилу, чтобы собрать образец. Затем накройте замороженный образец куском алюминиевой фольги или положите его обратно в образец трубки.
Быстро поместите собранный образец в контейнер, наполненный жидким азотом. Храните образцы при температуре минус 80 градусов по Цельсию до готовности к проведению наблюдения. Для начала установите температуру камеры образца криостата до минус 30 градусов по Цельсию, что обычно достаточно холодно, чтобы сохранить ксилемовый сок большинства растений в замороженном состоянии.
Используйте острый нож или мелкозубой пилы, чтобы обрезать образец на небольшой кусочек, который может быть скорректирован для образца держателя крио-SEM. Гора подстриженный кусок к патрону, держатель для криостата, с тканью замораживания встраивания среды для крио-секции. Прикрепите патрон к держателю образца микротома криостата.
Обрезать поверхность, неоднократно бритья от пяти до семи микрометров толщиной разделов. Отсеивания более 1000-2000 микрометров общей глубины до первоначальной поверхности полезно для урезания поврежденной части образца, вызванного предварительной резки. После примерной обрезки поверхности образца, отрегулируйте неиспользованную часть лезвия микротома над поверхностью образца.
Слегка расширяем расстояние между поверхностью образца и лезвием. И вырезать поверхность только один или два раза. Затем снова сдвиньте лезвие и распоистив неиспользованную часть лезвия на поверхность образца.
Повторите эту обработку резки три-четыре раза, чтобы получить чистую поверхность без следов ножа. После окончательного разреза установите положение лезвия далеко от образца, чтобы пыль не прилипания к образцу. И отделить патрон от микротомы.
Затем прикрепите образец к держателю образца крио-SEM с встраиваемой тканью среды в криостатической камере. Во-первых, используйте жидкий азот для поддержания температуры ниже минус 120 по Цельсию в камере образца крио-SEM в соответствии с руководством пользователя оборудования. Затем поместите держатель образца с подготовленным экземпляром в изоляционный контейнер, наполненный жидким азотом, в криостатической камере.
Используйте образец обмена стержня держать держатель образца под жидким азотом. Быстро перенесите держатель образца в камеру перед эвакуацией камеры крио-SEM, как только начнется эвакуация до эвакуационные камеры. Для начала включите разгонное напряжение электрической пушки.
Затем поднимите температуру стадии образца до минус 100 градусов по Цельсию. Подождите несколько минут, пока морозная пыль будет удалена, а уровень поверхности льда в клетках ксилема немного уменьшится по сравнению со стенками клеток. Затем понижайте температуру стадии спейена до минус 120 градусов по Цельсию.
В этом исследовании используются методы наблюдения крио-SEM для четкой визуализации распределения воды в клеточном масштабе. При низком увеличении черная область на снимках указывает на полости, из которых полностью или частично исчезает вода, в то время как серая область указывает на стенки ксилемовых клеток, цитоплазму и воду. При высоком увеличении становится очевидным, что вода не полностью теряется от люмины трех трахейдов, что указывает на появление макропарок в ксилемовом соке на месте.
Что касается широколивных видов, то возникновение кавитации легко обнаруживается в сосудах, в то время как существование воды трудно различить в волокнах, особенно при низком увеличении. Цитоплазмы и паренхимы клетки можно отличить от воды в tracheids или судов через текстуры ледяной плоскости. Анализ влияния температуры на процесс замерзания показывает, что морозная пыль постепенно сублимируется, а эндотрацидные ямо мембраны становятся яснее благодаря прогрессированию сублимации с повышением температуры.
Оставшиеся крупные частицы морозной пыли могут быть устранены путем дальнейшего замораживания травления. Но это может быть проблематичным, поскольку это неоправданно снижает уровень поверхности льда в ксилемных каналах. Высокое качество наблюдений в значительной степени достигается за счет точной подготовки образцов.
Особенно важно сглаживание поверхности острым лезвием микротомы. Недостаточное сглаживание использованного лезвия иногда может создать шероховатую поверхность, напоминающую следы ножа, или может создать многочисленные случаи пыли от порезов. Замораживание образца без ослабления отрицательного давления водяного столба вызовет артефактную индукцию кавитации в ксилемовых каналах.
Кластерные кристаллы льда наблюдаются в сосудах образцов, где образец не был расслаблен. Напротив, в расслабленных образцах с аналогичным водным потенциалом не наблюдается кластерных кристаллов льда. Применение замораживания-фиксации для транспирации живых растений, которые страдают от засухи, может вызвать артефакты на основе результатов, такие как кластерные кристаллы льда.
Эти артефакты приводят к неправильному толкованию состояния воды в ксилемовом канале. Поэтому важно сначала подтвердить водный потенциал образцов до замораживания-фиксации. Хотя эта процедура предусматривает изображение того, какой статус находится в ксилемовом канале, живое дерево должно быть уничтожено для наблюдения.
Сочетание других неинвазивных методов наблюдения, таких как МРТ или микро-КТ, с вспомогательным наблюдением изображения уровня углубит наше понимание природы между водным транспортом и использованием. Наблюдение за состоянием воды, введенной в настоящем документе, также обеспечит метод для выяснения взаимосвязи воды, которая смешивается в клетках и других анатомических реакций на абиотический или биотический стресс. Cryo-SEM, оснащенный энергодисперсивной рентгеновской спектроскопией или верхним симом, был использован для изучения распределения элементов по поверхности образца, содержащего воду.
Сочетание элементарного анализа и этой процедуры в этом аналогичном кадре может дать нам глубокие знания о поведении клеток ксилема, связанных со статусом воды. При использовании жидкого азота для замораживания-фиксации образцов в помещении, не забудьте проветрить помещение, чтобы избежать дефицита кислорода.
