Мутагенез, направленный на сайт, полезен для изучения молекулярных взаимодействий, таких как РНК-РНК и рнк белковых взаимодействий. В этом протоколе описывается, как выполнять мутагенез, направленный на сайт, с помощью двух- или 3-шагового ПЦР-подхода. Основными преимуществами метода являются разнообразие различных мутаций, которые могут быть включены, а также относительная легкость и стоимость для этого.
Для начала используйте шаблон ДНК дикого типа и грунтовое пар два, один, и два, три, специфичные для 2-шаг, или грунтовка пары три, один, и три, четыре, специфичные для 3-шаг ПЦР для получения PCR продукт один. Для проверки продуктов ПЦР агарозом гель электрофорез, сделать 2%agarose гель путем растворения двух граммов агарозы в 100 миллилитров 1X TAE буфера, используя микроволновую печь. Добавьте бромид этидия при конечной концентрации 0,5 микрограмма на миллилитр.
Затем отбрось агарозный гель. Когда затвердеет, поместите его в блок электрофореза. Загрузите лестницу ДНК известного размера, а образцы ПЦР, смешанные с красителем ДНК, загружаются в скважины.
Вы запустите образцы на 75 вольт в течение 45 минут. И визуализировать полосы на УФ-трансиллюминаторе или с системой визуализации геля. Затем очистите продукт ПЦР набором для извлечения геля в соответствии с протоколом производителей и измерьте концентрацию очищенной ДНК с помощью спектрофотометра.
Затем храните очищенную ДНК при температуре минус 20 по Цельсию в буфере TE. Чтобы начать объект-направленный мутагенез с 2-шаг pcR, сначала используйте шаблон ДНК дикого типа, затем грунтовки пар два, один и два, два, для пяти грунтовки мутаций, или грунтовки пары два, два, и два, три для трех грунтовки мутаций для получения PCR продукт два. Проверить продукт ПЦР с помощью гель-электрофореза, очистить продукт ПЦР и измерить его концентрацию, как описано ранее.
Затем используйте шаблон ДНК дикого типа и pcR продукт два в качестве грунтовки, вместе с грунтовки два, три для пяти грунтовки мутации, или грунтовки два, один для трех грунтовки мутации, чтобы получить продукт ПЦР три. Проверить продукт ПЦР с помощью гель-электрофореза, очистить продукт ПЦР и измерить его концентрацию, как описано ранее. Затем храните очищенную ДНК при температуре минус 20 градусов по Цельсию в буфере TE.
Для начала сайта прямого мутагенеза с 3-шаг ПЦР, сначала используйте шаблон ДНК дикого типа и грунтовки пары три, один и три, два, чтобы получить продукт ПЦР два. Используйте шаблон ДНК дикого типа и грунтовое пар три, три и три, четыре, чтобы получить продукт ПЦР три. Используйте шаблон ДНК дикого типа и грунтовое пар три, три и три, четыре, чтобы получить продукт ПЦР три.
Проверить продукт ПЦР с помощью гель-электрофореза, очистить продукт ПЦР и измерить его концентрацию, как описано ранее. Наконец, использовать два-пять нанограммов продуктов ПЦР два и три в качестве шаблона вместе с грунтовки пары три, один и три, четыре, чтобы получить продукт ПЦР четыре. Проверить продукт ПЦР с помощью гель-электрофореза, очистить продукт ПЦР и измерить его концентрацию, как описано ранее.
Храните очищенную ДНК при температуре минус 20 градусов по Цельсию в буфере TE. В этом исследовании, 2-шаг и 3-шаг сайт-направленный мутагенез были использованы для изучения взаимодействия РНК в отношении пост транскрипционные регулирования CsgD. Дикий тип CsgD был ПЦР усиливается, чтобы дать PCR продукт IA, и дикий тип mcaS был ПЦР усиливается, чтобы дать продукт ПЦР IB. Используя 3-шаговую стратегию ПЦР, продукты ПЦР IIA и IIIA были синтезированы в первые два этапа, а IVA на третьем этапе ввести мутации в CsgD.
Аналогичным образом, бесплатные мутации, направленные на сайт, были введены в mcaS для производства продуктов ПЦР IIB, IIIB, в первые два этапа, и IVB на третьем этапе. Западный анализ помарки показал, что в то время как выражение дикого типа mcaS предотвращает перевод дикого типа CsgD, мутации в либо mcaS или CsgD облегчает наблюдаемые репрессии. Однако мутации как в CsgD, так и в mcaS препятствуют переводу CsgD.
Используя 2-шаговую стратегию ПЦР, продукты ПЦР IIC, IID, IIE, IIF и IIG были синтезированы на первом этапе, а продукты ПЦР IIIC, IIID, IIIE, IIIF и IIIG, на втором этапе ввести мутации во всю ДНК CsgD. Результаты EMSA привязки КФЗ к транскрибированным csgD дикого типа CsgD и мутантным РНК, синтезированным с использованием продуктов ПЦР IIIC, IIID, IIIE, IIIF и IIIG, показали увеличение значений KD мутантных аллелей. Это доказало, что ХФЗ может менее эффективно связываться с мутантами.
Кроме того, УФЗ имеет несколько связывающих участков на CsgD, что показано на трех сменах, наблюдаемых для РНК дикого типа. Однако для различных РНК-мутантов наблюдаются только два связывающих участка. Таким образом, на сайте мутационный подход определяет первичные и или вторичные структуры csgD mRNA, которые важны для полного связывания HF.
Метод для сайта направлены мутагенез описано здесь опирается на ПЦР. Хорошие методы ПЦР имеют решающее значение для метода и могут потребовать оптимизации, чтобы быть успешным. Сайт-направленный mutagenesis только мощный со всеми тремя методами, такими как EMSA и Western Blotting.
Другие методы, например, включают различные структурные анализы и некоторые анализы деятельности, а также исследования по изменению после перевода.
