Этот протокол имеет важное значение для определения гликолитической функции и митохондриального дыхания в Candida albicans. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет измерять митохондриальную функцию без необходимости очищения митохондрий от Candida albicans. Этот метод может быть оптимизирован для исследования влияния генетических манипуляций или химических модуляторов на митохондриальные и гликолитические пути в альбиканах Candida или других грибковых патогенах.
Этот метод относительно прост. Или в зависимости от организма, их использование может помочь оптимизировать количество клеток и концентрацию митохондриальных ингибиторов в их анализе. В ламинарном капюшоне растворяют Поли-Д-лизин в тканевой сетке воды до конечной концентрации 50 микрограмм на миллилитр.
Смешайте раствор хорошо и aliquot его в 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки убедившись, что aliquot по крайней мере 1,3 миллилитров на трубку. Добавьте 50 микролитров этой смеси к каждому колодец анализной пластины, накройте крышкой и инкубировать при комнатной температуре в течение одного-двух часов. Затем аспирировать раствор.
Промыть колодцы анализной пластины один раз с 500 микролитров стерильной ткани культуры класса воды, открыть крышку и дать скважинам высохнуть. Если тарелку не использовать в день ее готовности, храните ее при четырех градусах по Цельсию максимум два-три дня. За день до эксперимента откройте дополнительный набор анализов потока и удалите содержимое.
Поместите сенсорный картридж вверх дном рядом с утилитой пластины. Заполните каждый колодец утилиты пластины с одним миллилитром калибранта, а затем поместить датчик картридж обратно. Убедитесь, что датчики, содержащие фторфоры, погружены в калибрант.
Инкубировать картридж датчика при 37 градусах по Цельсию в неуглеродного диоксида инкубатора на ночь. За день до анализа, привить подготовленные C albicans в бульоне YPD и расти на ночь при 30 градусов по Цельсию в шейкере при 200 об/мин. В день анализа разбавляют соответствующее количество клеток в среде анализа, чтобы дать окончательную концентрацию 100 000 клеток на 100 микролитров.
Добавьте 100 микролитров разбавленных клеток в каждую скважину анализной пластины, за исключением скважин A1, B4, C3 и D6. К этим скважинам добавьте всего 100 микролитров среды анализа для фоновой коррекции. Инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия в неуглеродный инкубатор диоксида в течение 60 минут, чтобы клетки придерживаться поверхности пластины. Подготовь соединения для анализа митохондриальной функции при концентрации 10X в соответствующей среде анализа, изложенной в текстовом протоколе.
Добавьте 50 микролитров SHAM в порт А, 50 микролитров олигомицина в порт B, 62 микролитров цианида калия в порт С и 68 микролитров антимицина А в порт D.Next, подготовьте соединения для анализа гликолитического стресса при концентрации 10X в соответствующей среде анализа, изложенной в текстовом протоколе. Добавьте 50 микролитров глюкозы в порт А, 55 микролитров олигомицина в порт B, 62 микролитров 2-DG в порт C и 68 микролитров Антимицина А в порт D.Before the assay откройте дополнительный анализатор потока и наладив шаблон анализа анализа, используя вкладку мастера анализа, используя вкладку мастера анализа. Следуйте пошаговому инструкции и заполнить всю информацию, которая выскочить во время установки.
Создать макет группы и настроить протокол, изложенный в текстовом протоколе. Сохраните эти макеты до анализа. Во время анализа восстановите сохраненный протокол, открыв соответствующий файл в варианте открытого файла во вкладке мастера анализа.
Затем загрузите соединения 10X в соответствующие порты гидратированного сенсорного картриджа, содержащего калибрант. Загрузите сенсорный картридж в лоток несущей дополнительного анализатора потока. Начните калибровку, нажав кнопку «Пуск» на экране.
Затем аккуратно добавьте 350 микролитров среды анализа к клеточной пластине вдоль стенок, чтобы свести к минимуму нарушение работы клеток, доведя конечный объем до 450 микролитров. Замените утилиту, содержащую калибрант, на анализную пластину и продолжайте анализ. Как только анализ будет завершен, удалите сенсорный картридж и пластину.
Сохраните файл в соответствующей папке назначения. В этом исследовании, био-энергетические функции C albicans оцениваются дополнительным анализатором потока. Мутант не хватает митохондриального белка mam33 также включен вместе с его дополнением штамма для изучения влияния удаления митохондриального белка на уровень потребления кислорода и внеклеточного подкисления.
Дикий тип C albicans показывает скорость потребления кислорода 145 пикомолов в минуту, что находится в пределах оптимального диапазона для любого внеклеточного анализа потока. Базальная скорость потребления кислорода дикого типа, mam33 мутантов и mam33 дополненных штаммов не показывают никаких различий. Аналогичным образом, никаких существенных различий в базальных внеклеточных темпов подкисления между штаммами не наблюдается.
Однако, путем ингибирования комплекса-IV с цианидом калия, дикий тип и mam33 мутант, mam33 дополненные штаммы показывают значительный сдвиг в сторону гликолиза. Mam33 мутант штамм однако не удалось показать компенсационный гликолитический сдвиг, предполагая, что соединение-IV зависимый путь нарушается в этом штамме. В гликолитический стресс-тест, клетки голодают глюкозы в течение одного часа и базальной скорости потребления кислорода и внеклеточной подкисления измеряется.
После голодания штамм мутантов mam33 значительно снижает потребление кислорода и показатели внеклеточного подкисления по сравнению с другими штаммами. Это говорит о нарушении использования глюкозы как для дыхания, так и для гликолиза, когда клетки вынуждены голодать. После введения глюкозы, все штаммы показывают стимуляцию как их скорости потребления кислорода и внеклеточной скорости подкисления.
Покрытие анализной пластины позволяет клеткам Candida albicans прилипать к пластине. Неправильное соблюдение Candida Albicans клетки будут влиять на результат анализа. После разработки этого метода, он был использован в широком диапазоне типов клеток и заболеваний, касаясь того, как митохондрии функции во время физиологических и патологических состояний.
Например, используя в этом анализе клетки, полученные пациентом, и контрольные клетки, можно решить конкретные вопросы о том, как изменяется митохондриальная функция. Следует позаботиться о подготовке митохондриальных ингибиторов, таких как цианид калия и антимицин А, потому что эти соединения чрезвычайно ядовиты.
