Комплексная процедура оценки взаимодействия между дополнением белка C1q и гиалуроновой кислоты в содействии клеточной адгезии. Недавно мы определили, что комплементный компонент C1q молекула врожденной иммунной системы высоко выражена в микроокурении опухоли и плаценты и способна взаимодействовать с компонентом внеклеточной матрицы. В этом случае гиалуроновая кислота.
Мы предлагаем метод изучения биологических функций белков во всей экрономической среде. Для того, чтобы исследовать способность этих молекул формировать свойства деления клеток внеклеточных матричных факторов. Для того, чтобы изучить, как это взаимодействие может быть почувствовать клетки, присутствующие в тканях окружающей среды, мы создали этот простой метод, в котором бинарные клетки, полученные из человеческих тканей было разрешено придерживаться C1q связаны с внеклеточной матрицы, в данном случае гиалуроновой кислоты.
Для процедуры покрытия первым шагом является связывание высокой молекулярной массы гиалуроновой кислоты с 96 хорошо ткани покрытием микроплюс. Для покрытия гиалуроновая кислота разбавляется в буфере углерода 0,1 моль PH 9.6 при концентрации 15 микрограмм на миллилитр. И нежно трубы реквихи для достижения однородного решения.
Для покрытия колодцев используются 100 микролитров раствора. Пластина затем передается при четырех градусах по Цельсию в одночасье. На следующий день вакуум аспирируют обработанные скважины.
Вымойте один раз с dPBS. Добавить либо C1q или BSA в соответствующих скважинах. C1q в настоящее время коммерчески доступен при концентрации одного миллиграмма на миллилитр и разбавляется при концентрации 25 микрограмм на миллилитр.
И dPBS, содержащий 0,5%BSA и 0,7 миллимолеса кальция и магния и дивалентных cations. BSA LPS бесплатно используется в концентрации 0,5% и дата PBF. Плита затем передается при четырех градусах по Цельсию на ночь.
C1q доза зависимых взаимодействий с иммобилизованной гиалуроновой кислоты определяется ферментом связаны иммуно SA. Ячейки маркировки с быстрым DiI. Липофильные трассировщик быстро DiI используется для обозначения клеток, представляющих интерес. Клетки, перерасходуемые в dPBS, используются при концентрации одного миллиона клеток на миллилитр.
Fast DiI разбавляется от одного до 100 непосредственно в клеточной подвеске. Подвеска клетки смешивается вручную и передается при 37 градусах по Цельсию в течение 15 минут. После пяти минут инкубации смешайте подвеску клетки и повторите эту операцию еще дважды.
Чтобы удалить избыток быстрого DiI, добавьте 10 миллилитров dPBS. Pivot осторожно вверх и вниз и центрифуги на 250 г в течение семи минут. Повторное увеличение клеточной гранулы в одном миллилитре эндофильной сыворотки человека свободной среды в присутствии 0,1%BSA.
Клетки адгезии на гиалуроновой кислоты C1q матрицы. Вакуумный аспират dPBS из колодцев с покрытием. Распределим 100 микролитров маркировки клеточной подвески на скважины с покрытием.
200 микролитров помеченных клеток разорены в эппендурной трубке, которая будет использоваться для стандартного генерации кривой. Инкубировать пластину в течение 35 минут при 37 градусах по Цельсию. Вынул тарелку из инкубатора.
Аккуратно аспирировать несбалансированные клетки. Вымойте один раз с dPBS содержащие 0,5%BSA и 0,7 миллимолеса кальция и магния. Lys адепт клеток, добавив 200 микролитров лиза буфера.
В то же время подготовить стандартную кривую на один-два серийного разбавления помеченных ячеек в буфере лиза. Выполните чтение сигнала флуоресценции на бесконечном приборе F 200 T-can, используя 544 нанометров в качестве восклицательные длины волны и 590 нанометров в качестве длины волны выбросов. Результаты представительов.
Как показали репрезентативные результаты, очевидно, что клеточное деление на гиалуроновой кислоте обнаружило, что C1q сильно усиливается по сравнению с только HA или HA связанным BSA. Процент адептов клеток на каждой матрице рассчитывается на основе стандартной кривой. Выводы. В наших экспериментах в первую очередь мы оценивали способность компонента дополнения C12 связывать внеклеточную матрицу в данном случае гиалуроновой кислотой с использованием арисального металла.
Во-вторых, мы проанализировали способность первичных клеток человека, окрашенных флуоресцентным красителем, преследовать связанную гиалуроновую кислоту. Модель, которую мы предложили в этом исследовании, является более легким и дешевым методом в качестве альтернативы 3D-модели внеклеточных матричных эшафотов для оценки этой клеточной реакции на сочетание стимулов.
