Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, такие как, как метаболизм энергии в тканях сетчатки отличается между биологическими образцами, или после воздействия фармакологических агентов. Основным преимуществом этого метода является то, что он использует эксплантированные органотипические ткани сетчатки для измерения темпов как гликолиза, так и окисленного фосфорилирования и позволяет проводить оценки вмешательств в пробирке в режиме реального времени. Для калибровки приборов для внеклеточного потока анализа сначала добавьте один миллилитр калибровочного раствора к каждой колодец из 24 картриджа датчика хорошо, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в Co2 бесплатно инкубатор на ночь.
Загрузите добавки для протокола митохондриального стресса или протокола гликолиза в каждый инжекторный порт на сенсорном картридже, регулируя для изменения громкости в колодец. Предполагая первоначальный объем хорошо 450 микролитров, типичный анализ будет включать в себя 45 микролитров добавки в первый порт инжектора, 49,5 микролитров во второй, 54,5 микролитров в третий, и 60 микролитров в последний. В течение первых нескольких экспериментов, нагрузка базы среды в порт, чтобы оценить, сколько артефакт движения тканей происходит после инъекции порта.
Разрешить загруженной сенсорной пластины инкубировать при 37 градусов по Цельсию в не Co2 инкубатор, по крайней мере 60 минут. Начните изоляцию свежей ткани сетчатки мыши с помощью свежеиспеченной мыши. Используйте пару средних изогнутых типсов, чтобы схватить задний глобус на зрительном нерве, и осторожно применять давление вперед, чтобы опора глаза.
С чистым лезвием бритвы, создать лимбус лимбус разрез через роговицу с помощью одного, преднамеренного прохода лезвия. Используя тонкий угловой МакФерсон стиле щипцы, щепотку заднего глобуса, чтобы выразить объектив и передние мембраны гилоидов из разреза роговицы. Повторите щипать маневр с щипся, чтобы выразить нервной сетчатки.
Затем используйте миппы, как ложка, чтобы поднять сетчатку от разреза роговицы. Поместите сетчатку прямо в теплую среду в трехметровую тарелку, или шести хорошо ткани культуры кластерной пластины. Далее, используйте две пары тонких угловых forceи McPherson, чтобы аккуратно вскрыть оставшиеся стекловидного глаза от сетчатки.
Это лучше всего сделать, хватая стекловидное тело на периферии чашки сетчатки, и потянув к центру, с окончательным disinsertion стекловидного тела из центра в целом. Затем удалите любой остаточный пигмент сетчатки эпителия с поверхности фото-рецептора сетчатки. Вырезать P1000 пипетки кончик с лезвием бритвы, чтобы создать приблизительное четырехмиллиметровое отверстие, чтобы предотвратить неоправданную травму деликатной ткани сетчатки во время передачи маневров.
Затем используйте наконечник пипетки для переноса изолированной ткани сетчатки в свежую среду. Наконец, используйте один миллиметр биопсии удар оснащен поршень, чтобы сократить удары сетчатки вокруг зрительного нерва. Установите сетчатки ударов в сторону в чистой среде, хранится на 37 градусов по Цельсию блок, или грелка.
После того, как нужное количество ударов были собраны, используйте милые P1000 отзыв аспирировать индивидуальный удар в 450 микролитров среды, и передать его в 24 хорошо глаз захвата микро пластины на 37 градусов по Цельсию тепловой панели или теплового блока. Используйте тонкие прямые типсы, чтобы аккуратно манипулировать ударами в центр микро пластины. Держите удары ориентированы в том же направлении.
Например, с ганглия ячейки стороне вверх. Для каждого эксперимента выделить три-четыре пустые скважины с 450 микролитров базовой среды, чтобы служить в качестве отрицательного контроля. Избегая пузырьков воздуха или чрезмерного движения, аккуратно распорежьте сетку захвата глаз вставки в каждую колодец, и закрепите вставки металлическим поршенем или с разрезом наконечником пипетки P1000.
Хотя микрокамера имеет достаточную глубину для размещения типичной сетчатки мыши, иногда дефекты машины в сетчатых вставок делают причиной ткани, чтобы стать чрезмерно сжаты во время вставки экрана. Если это произойдет, просто сделать к сведению эту измельченную ткань, и исключить этот образец из окончательного анализа. Инкубировать пластины ткани в 37 градусов по Цельсию двуокиси углерода инкубатор, по крайней мере 60 минут.
Запрограммируйте дополнительный анализатор клеточного потока, используя команды смешивания, веса, измерения и повторения. Например, типичный эксперимент с ткани сетчатки может включать в себя следующее. Смешайте две минуты, подождите две минуты и измерьте пять минут.
Повторите эксперимент с этими тремя шагами от пяти до восьми раз для записи базовой линии, и после инъекции каждого соединения проходит тестирование. Нажмите кнопку запуска программы на экстраклеточном анализаторе потока и следуйте инструкциям на экране, чтобы вставить картридж датчика для калибровки. В конце калибровки следуйте инструкциям на экране, чтобы заменить калибрантную пластину пластиной, содержащей образцы сетчатки, а затем позволить программе работать как запрограммировано.
По завершении пробега следуйте инструкциям на экране, чтобы извлечь пластину ткани. Просмотр результатов запуска и хранение файла данных. С согнутыми 20 калибровочных игл и типсов, удалить все сетчатые вставки из колодцев, оставив сетчатки удар позади.
Тщательно аспирировать среду из ткани, и мыть ткани в два раза с 0,5 миллилитров холодного фосфата буфера солевого раствора. После аспирации второй PBS мыть, добавить 100 микролитров лиза буфера для каждой стирки, и пипетки вверх и вниз, чтобы гомогенизировать ткани. Наконец, количественные уровни ввода на основе общего двойного содержания ДНК, разбавляя облизанные образцы один к одному, со 100 микролитров буфера Tris-EDTA, и передачи 100 микролитров разбавленного образца на пластину 96 хорошо.
Затем добавьте 100 микролитров буфера обнаружения к каждой колодец и перемешайте в течение двух-пяти минут. Наконец, квантитат флуоресценции после возбуждения на 480 нанометров и выбросов на 520 нанометров по сравнению со стандартной кривой. Нормализует внеклеточный поток, отслеживая содержимое ДНК в колодец.
На базовой линии, в присутствии пяти милли глюкозы мюллера и в присутствии 10 милли мюллер пируват, нет существенной разницы в скорости кислотного эфлюкса, измеряется внеклеточной скорости подкисления. Между тканями сетчатки от животных типа хитрости, или выбить мышей, которые не имеют механизма, чтобы закрыть циклические нуклеотидные закрытые ионные каналы в ответ на световые раздражители. Аналогичные закономерности наблюдается после добавления 20 милли мюллер глюкозы и гликолитический ингибитор 2DG.
Эти данные могут быть математически преобразованы для представления дробных изменений от базового уровня, формата, который может позволить лучше сравнивать различные экспериментальные вмешательства. Абсолютный уровень потребления кислорода на базовом уровне также эквивалентен между контролем и мутантной ткани сетчатки. Добавление 20 милли глюкозы мюллера увеличивает митохондриальное дыхание, но никаких изменений в наблюдаемых между группами с точки зрения абсолютной количественной оценки или с точки зрения изменения от базового уровня.
Добавление одного милли мюллера FCCP, развязающий агент, чтобы продемонстрировать максимальные митохондриальные дыхательные ставки не значительно увеличить OCR выше уровня видели с высоким содержанием глюкозы в контроле и мутант ткани сетчатки. Тем не менее, сигналы от обеих мышей резко падают после добавления коктейля RAA. В заключение мы демонстрируем методику количественной оценки показателей окисленного фосфорилирования и гликолиза в органотипических эксплантах сетчатки мыши.
При эффективной изоляции тканей сетчатки, техника дает надежные и reproudcable измерений. В режиме реального времени можно оценить воздействие воздействий, таких как размекаемые агенты. В дополнение к этой процедуре, другие методы, такие как количественные RTPCR и западные blotting, могут быть выполнены на излишки ткани изолированы в шаге вскрытия для получения параллельной информации, относящейся к исследованиям метаболизма сетчатки.
