Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о ферментах фосфотрансфера, включая специфичность ферментного субстрата и реакцию кинетики. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет быстро сбор нескольких наборов данных, которые являются очень последовательными, что позволяет статистически надежную количественную оценку активности ферментов. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку обнаружение реакций на пластинах TLC и количественная оценка радиоактивных видов в реакциях гораздо легче продемонстрировать, чем объяснить.
В дополнение к Astha, демонстрируя процедуру будет Азия Poudel, другой аспирант из моей лаборатории. Начните этот протокол с неудобовательного переэкспрессии белка с гистидином, как описано в текстовом протоколе. Подготовка одного миллилитра никеля нитрилоацетической кислоты смолы в гравитационном столбе для очистки белка.
За день до использования, уравночные столбец ночь на четыре градуса по Цельсию с двумя миллилитров эквилибрации буфера. На следующий день довести столбец от четырех градусов по Цельсию до комнатной температуры до загрузки очищенного лизата и дайте ему постоять около двух-трех часов. Затем повторное приостановление гранул в буфере лиза.
Sonicate клетки на льду в течение 10 раз 10-секундных интервалов, останавливаясь 30 секунд между импульсами. Уточните лизат центрифугой при 3, 080 раз г в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия с помощью микроцентрифуга. Подготовь уточненный лизат с равными объемами буфера лиза, затем примените готовый, уточненный лизат к столбецу и соберите протекаемый поток.
Повторное приколоть уточненный лисировать поток через столбец и собирать вторичный поток через. Затем вымойте столбец с пятью миллилитров мыть буфера один и собирать поток через. Вымойте столбец снова с пятью миллилитров мыть буфера два и собирать поток через.
Теперь примените два миллилитров буфера элюции. Соберите поток через две фракции по одному миллилитру каждый. Во время очистки белка включение хлорида магния в буферы очистки, изменение протокола производителя, имеет важное значение для энзиматической активности.
Чтобы качественно оценить очистку белка SDS-PAGE, запустите 20 микролитровых алицитов всех фракций столбца на 4%stacking, 10%бегущий полиакриламидный гель в течение 60 минут при 170 вольтах. Пятно гель с 0,1%Coomassie синий при комнатной температуре в течение пяти часов, качаясь мягко на скамейке рокер. Затем destain гель в 40%метанол-10%ледниковой уксусной кислоты ночь при комнатной температуре, качаясь на скамейке рокер.
Диализ eluted фракции два против диализа буфера на 200:1 соотношение с использованием одного миллилитров диализа устройство с 20-килодальтон молекулярного веса отсечения ночь на четыре градуса по Цельсию. Определите концентрацию диализированного образца белка, измерив абсорбанс на 280 нанометров и используя рассчитанный коэффициент вымирания моляров. Храните 100-микролитровые алициты образца диализируемого белка при температуре минус 80 градусов по Цельсию до его использования.
Перед выполнением реакции, подготовить PEI целлюлозы тонкого слоя хроматографии пластин, мыть их в деионизированной воде. Поместите пластины в стеклянную камеру с двойной дистиллированной водой на глубину около 0,5 сантиметра. После того, как вода мигрирует в верхней части пластины, принести пластины из стеклянной камеры и оставить на скамейке стойки высохнуть на ночь.
Отметь высушенные пластины в двух сантиметрах от одного края мягким карандашом, чтобы указать, где образцы будут применяться для TLC. Для двухмиберных образцов применяют образцы не менее чем на один сантиметр друг от друга. При планировании экспериментов, всегда оставляйте одно место на каждой пластине неиспользованными, чтобы служить пустой полосой для количественной оценки выборки.
Для выполнения анализа активности ферментов, подготовить индивидуальные реакции с использованием гамма P32 АТФ, как описано в текстовом протоколе. Добавьте RSH после смешивания других компонентов, так как добавление RSH в нуклеотидсодержащую смесь инициирует анализ энзиматической активности. Для контроля гидролиза АТФ от загрязняя активность нуклеазы, собрать 10-микролитер реакции, не содержащие белка и инкубировать его параллельно.
Обнаружить двухмиберные образцы на T равны нулю и в конце эксперимента, чтобы убедиться, что АТФ не был гидролизовается в отсутствие белка. Сразу же после добавления RSH, удалить два микролитера и пятно его на помечены PEI-целлюлозной пластины, как T равна нулевой минуте образца. Инкубировать реакцию при 37 градусах по Цельсию, удаляя двухмиллерные алициты в нужных точках времени.
После того, как все алициты были собраны, выполните тонкослойную хроматографию, заполнив хроматографическую камеру 1,5-молярным монобазным фосфатом калия на глубину 0,5 сантиметра. Погрузите нижний край пластины в растворитель и позвольте растворителю мигрировать в верхнюю часть пластины в течение примерно 90 минут. Снимите пластину с хроматографического бака и поместите ее на скамейку сушилки для сушки воздуха на ночь.
После того, как пластина высохнет, оберните пластину в пластиковую пленку, чтобы избежать передачи радиоактивного материала на кассету с изображением и проанализируйте с помощью ауторадиографии. Разоблачить пластину PEI-целлюлозы, содержащую разделенные реакции на кассету фосфоримагера в течение четырех часов при комнатной температуре. После экспозиции, изображение кассеты на фосфоримагер.
Используя программное обеспечение для визуализации с графическим пользовательским интерфейсом, нарисуйте области интереса или ИП, сначала выбрав Draw a Rectangle, затем используйте мышь, чтобы нарисовать прямоугольные ИП вокруг одной целой полосы движения, а также точки АТФ и гуанозина-тетрафосфата, содержащиеся в этой полосе. Используйте команды Select, Copy и Paste, чтобы нарисовать одинаковые ИИ в других полосах движения, чтобы гарантировать, что ИИ измеряют сигнал в одинаковых областях в каждой полосе движения. Включите ROIs из неиспользованной полосы, которая будет использоваться в качестве пробелов.
Используя анализ, инструменты, roi Manager, Добавляйте команды программного обеспечения для визуализации, выберите все ИИ, нарисованные на пластине PEI-целлюлозы. Теперь используйте команды Analyze, Set Measurements, Measure для количественной оценки интенсивности сигнала в рамках каждой рентабельности инвестиций и экспорта измерений в виде спредов. В электронной таблице вычесть пустые значения рентабельности инвестиций из экспериментальных сигналов.
Преобразование данных в процент гуанозин-тетрафосфат синтезированных имеет решающее значение, потому что это гарантирует, что наборы данных, собранные в разные дни с различными партиями белка или различных гамма P32 АТФ являются последовательными и могут быть объединились для статистической строгости. Эта карикатура демонстрирует, как регионы, представляющие интерес, используются для определения полосы, которая содержит общий радиоактивный сигнал в образце и компонент радиоактивных АТФ и гуанозин тетрафосфатных областях, представляющих интерес. Тетрафосфатные сигналы АТФ и гуанозина нормализуются до общего сигнала, а не сообщают абсолютные значения, поскольку ошибка трубопроводирования или распад радиоактивного субстрата может повлиять на общий сигнал в образце, но не повлиять на активность ферментов.
Здесь показана фактическая пластина TLC реакции, выполненной с использованием очищенного C.difficile RSH. Контрольная реакция, не содержащая белка, позволяет количественно определить гидролиз АТФ без стечения атФ, в то время как пустая полоса позволяет точной количественной оценки сигнала. В точках АТФ и гуанозин-тетрафосфат фермент передает радиоактивный фосфат из субстрата АТФ в прекурсор ВВП, создавая радиоактивный тетрафосфат гуанозина.
Это подтверждает, что если ставить гуанозин тетрафосфат синтетазы из C.difficile является активным ферментом. При отборе проб реакции с интервалами можно наблюдать прогресс. Здесь необработанный сигнал наблюдается в каждой точке времени.
АТФ уменьшается, а тетрафосфат гуанозина увеличивается. Здесь показаны нормализованные данные. Бары ошибок гораздо меньше, потому что нормализация объясняет любую ошибку пипетки.
При попытке этой процедуры, важно быть осторожным, чтобы не поцарапать смолу на пластине TLC, так как это может помешать миграции растворителя. Это очень доступный метод с простым анализом данных, который может быстро обеспечить надежную количественную оценку активности ферментов. Мы использовали его, чтобы подтвердить, что Clostridium difficile синтезирует тетрафосфат гуанозина, о котором ранее не сообщалось.
Не забывайте, что работа с радиоактивностью может быть чрезвычайно опасной, и вы должны следовать правилам вашего учреждения для хранения и использования радиоактивных материалов при выполнении этой процедуры. Этот метод может дать представление о синтезе тетрафосфата гуанозина, но он также может быть применен к другим фосфатным реакциям, включая активность белка киназы и циклический синтез дигуанилатов.
