Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области неврологии и традиционной пероральной медицины исследований о скрининге на нейропротекторные природные соединения, имеющие отношение к модели. Основным преимуществом этого метода является то, что более высокая продуциатость объема инфекции в соответствии с ишемической дозой времени. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку это типично для вставки очень тонкой реализации в оригинал, средней мозжечковой артерии с помощью стерильного микроскопа.
Демонстрацией процедуры будет Се-Ен Ли, ученик школы, обучающийся в моей лаборатории. Для приготовления экстракта Glycyrrhizae Radix et Rhizome, или GRex, сначала добавьте 200 граммов glycyrrhizae Radix et Rhizome, или GR, к двум литрам метанола в течение пятидневной инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации процедите раствор через фильтровальную бумагу толщиной 0,26 миллиметра размером с пять микрометров.
Добавьте остатки GR в один литр свежего метанола и снова профильтруйте раствор. Смешайте два фильтра и процедите их через новый лист фильтровальной бумаги. Затем сконцентрировать экстракт под вакуумом перед замораживанием сушки для производства GRex.
Чтобы подготовить GRex к администрированию, растворите лиофилизированный продукт в диметилсулфоксиде и разбавьте смесь физиологическим солевым раствором 0,9%. Затем отфильтруй раствор через фильтр шприца 0,45 микрометра, и настроить окончательную концентрацию DMSO до менее чем 5% Чтобы создать мышь средней мозговой артерии окклюзии модели, или MCAO, подтверждают отсутствие реагировать на хвост стимул в анестезированной шестинедельной 22 до 25-граммовый мужчина C57BL/6 мыши, и поместите мышь на 36,5-градусный температуры тела проведения одеяло, подключенное к термометру. После удаления всех волос с груди и шеи мыши путем бритья и депиляативного крема, поместите мышь под стереомикроскоп и сделайте двухсемейный разрез кожи в центре шеи.
Тщательно изолируйте левую общую сонную артерию, внешнюю соонную артерию и ветку внутренней сонной артерии от окружающих соединительных тканей, и используйте 4,0-шелковый шов, чтобы подцепить внешнюю соонную артерию и общую сонную артерию полумоком узлом, чтобы временно блокировать кровоток во внутреннюю соонную артерию. Вставьте 0,1 до 0,12 миллиметра толщиной 11-миллиметровый силиконовый покрытием 8,0-монофиламент 4,0-шелковый шов через внутреннюю соонную артерию к происхождению левой средней мозговой артерии, и использовать лазерный метр потока Доплера для измерения уменьшения относительного мозгового кровотока артерии. Зафиксите вставленную нить к кровеносным сосудам на 2 часа пока церебральная артерия occluded.
В конце периода окклюзии, тщательно снять нить для восстановления кровотока в течение 22 часов reperfusion. И использовать 3,0-шелковые швы, чтобы швы кожи в пяти местах с двумя половинами заминок узлов. Затем верните мышь в клетку для анестезии восстановления.
Через час после окончания реперфузии, введать 300 миллиграммов на килограмм массы тела GRex для экспериментальных животных, только устные gavage. Через 24 часа после начала MCAO, сделать разрез в средней коже головы каждого экспериментального животного, и разорвать теменной кости с угловыми мипсами, в то время как пилинг от dura mater. Тщательно изолировать мозг от черепа, и использовать матрицу мозга мыши, чтобы сократить вырезанной ткани на один миллиметр толщиной разделов.
Пятно разделов в течение 17 минут в 2%TTC решение, в соответствии со стандартными протоколами. И исправить разделы в 10%формалин, по крайней мере за 2 часа до изображения образцов с цифровой камерой. Затем проанализируйте и количественно оцените область инфаркта головного мозга в каждом разделе с помощью ImageJ.
В соответствующий экспериментальный момент времени после MCAO, perfuse каждого усыпляется экспериментальных животных транскардиально с 10-миллилитров PBS, а затем 10-миллилитров 4%paraformaldehyde. После изоляции мозга, как только что продемонстрировано, погрузить собранные органы в 10-миллилитров 30% сахарозы в одночасье. На следующее утро встраиваем образцы тканей мозга в оптимальное температурный состав.
И нарежьте ткани коронально на 15-микрометровые секции на киростате. Намонтировать секции на стеклянных горках и погрузить секции в 80% этанола в течение 1 минуты. Для Окрашивания H и E, этикетка образцов с раствором гематоксилина в течение 5 минут, а затем два падения в 1%кислотный алкоголь.
Затем погрузите слайды в насыщенный карбонатный раствор лития в течение 30 секунд, а затем 30-секундную стирку в водопроводной воде и 30 секунд противоокрашивания раствором эозин. Удалите избыток раствора эозин с промывки водопроводной воды, и обезвоживать слайды с одной минуты восходящего погружения в 95, то 100% этанола. Затем, airdry слайды, очистить их в ксилена, по крайней мере 10 минут, и смонтировать крышки с монтажной среды.
Для крезилового фиолетового окрашивания поместите 80%-этанол обработанные слайды на слайде теплее, по крайней мере один час, а затем погружение в 50% этанола разбавленной хлороформом на ночь. На следующее утро, пятно слайды с 0,1%cresyl фиолетовый в течение 10 минут в 40-градусной по Цельсию сухой духовке, а затем обезвоживание в 95% этанола в течение 30 минут, и два пятиминутных 100%этанол погружения. Далее очистим горки от двух пятиминутных погружений в ксилен, за которыми последует высыхание воздуха.
Затем смонтировать слайды с монтажной средой для визуализации с помощью световой микроскопии. В фиктивных нормальных группах не наблюдается инфаркта головного мозга; в то время как в контроле, необработанных животных MCAO, относительно широкий спектр поврежденных участков не наблюдается. При 300 миллиграммах на килограмм обработанных GRex моделей мышей наблюдается статистически значимое снижение поврежденных тканей.
Гистологический анализ секций H и E и cresyl фиолетовый окрашенных тканей обеспечивает индекс выживаемости клеток. Действительно, Н И Е и cresyl фиолетовый окрашивания интенсивности значительно уменьшить контроль, необработанные группы MCAO по сравнению с фиктивным нормальной группы. GRex-обработанных животных, с другой стороны, проявляют большую гистологическую целостность, подразумевая меньше нейрональной гибели клеток, чем как контроль, необработанные и фиктивные управляемых групп, предлагая мощный нейропротекторный эффект экстракта против ишемии реперфузии индуцированной черепно-мозговой травмы.
При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы контролировать относительный мозжечковый кровоток в этот период. И проводники процессов очень тщательно, чтобы свести к минимуму повреждения эндотелиальных слоев
