Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области энергетики, такие как митохондриальное здоровье, энергоэффективность и потребление энергии. Основным преимуществом этого метода является то, что потребление кислорода изолированных митохондрий измеряется непосредственно. Результаты не должны быть исправлены для других внутриклеточных метаболических процессов.
Сначала мы решили использовать этот метод в молочном животноводстве, когда мы хотели изучить, как митохондриальная эффективность влияет на эффективность кормов. Видео демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку шаги в митохондриальной изоляции трудно узнать, потому что они должны быть последовательными и точными. Как можно скорее после того, как образец печени удаляется из коровы мыть образец в митохондрии изоляционных средств для удаления красных кровяных телец.
Использование ножниц мелко фарш ткани в охлажденный стакан, который содержит достаточно изоляции средств массовой информации, чтобы сохранить ткань влажной. Перенесите рубленую печень в 30-миллилитровый стеклянный флакон, содержащий средства изоляции митохондрий. Добавьте тефлоновый пестик, который имеет клиренс 0,16 миллиметра и который был инкубирован во льду и гомогенизировать образец печени при 500 об/мин в течение одной минуты с четырьмя ударами в минуту.
После этого перенесите гомогенат в трубку, содержащую средства изоляции митохондрий, и поместите его в стакан со льдом. Центрифуга гомогенат в 500 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут. Отбросьте гранулы и перенесите супернатант в охлажденную центрифугу.
Центрифуга в результате супернатант на 10000 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут, чтобы получить митохондриальные гранулы. Resuspend и мыть гранулы в 10 миллилитров митохондрий изоляции средств массовой информации с жирной кислотой, свободной BSA. Затем центрифуга при 8, 100 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут.
Откажитесь от супернатанта и перерасходуйте гранулы в 200 микролитров изоляционных средств массовой информации. Поместите это на лед, пока не будет готов к использованию для потребления кислорода и протон утечки кинетических анализов. Определите концентрацию белка подвески гранул с помощью комплекта бицинхониновой кислоты в соответствии с инструкциями производителя, используя BSA в качестве стандарта.
Во-первых, создать средства потребления кислорода, как указано в текстовом протоколе. Инкубировать потребление кислорода средств массовой информации на 30 градусов по Цельсию. Затем установите камеру дыхания, насос и кислородный электрод для оксиграфной системы в соответствии с инструкциями производителя.
Затем поместите один миллилитр средств потребления кислорода в камеру дыхания. Затем добавьте в камеру 0,35 миллиграмма митохондриального белка. Тщательно перемешайте, чтобы раствор насыщается воздухом и поддерживать температуру 30 градусов по Цельсию.
Запись потребления кислорода в течение примерно пяти минут. Когда потребление кислорода становится постоянным, представленным уменьшением прямой линии, записывают это как базовое потребление кислорода. Добавьте 1,25 микролитра раствора четырехмимолярного ротенона, чтобы ингибировать сложный раствор, а затем добавьте пять микролитров одного раствора молира сукчината, чтобы достичь конечной концентрации пятиминолярного сукчината в дыхательной камере.
Это состояние IV потребления кислорода. После этого добавьте один микролитр 100-миллиметрового раствора ADP, чтобы достичь окончательной концентрации 100 микромолеров в камере дыхания. Потребление кислорода будет снижаться в течение примерно пяти минут, а затем станет прямой линии.
Запись этого потребления кислорода в качестве государства III дыхания. Рассчитайте коэффициент контроля дыхания, изложенный в текстовом протоколе. Затем аспирировать все решения из камеры дыхания.
Промыть камеру несколько раз двойной деионизированной водой. Во-первых, подготовить раствор 80 нанограмм на миллилитр нигерицина в этаноле, ограничивающий количество этанола, добавленного до менее чем одного микролитра. Также приготовьте раствор из восьми микрограмм на миллилитр олигомицина в этаноле.
После тщательного полоскания камеры двойной деионизированной водой поместите один миллилитр средств потребления кислорода в камеру дыхания и энергично перемешивайте с помощью магнитного батончика. Добавьте в камеру дыхания 0,35 миллиграмма митохондриального белка. Добавьте метилтрифенилфосфоний чувствительный электрод к установке камеры убедившись, что другой конец правильно подключен к рН метр.
Добавьте 1,25 микролитра раствора четырехмимолярного ротенона, чтобы ингибировать комплексное I.Запись дыхания в течение двух-пяти минут. Запись значения потребления кислорода, когда он становится постоянным. Затем добавьте 0,56 микролитров раствора олигомицина, чтобы препятствовать использованию ADP.
Запись дыхания в течение примерно двух-пяти минут. Запись значения потребления кислорода, когда он становится постоянным. Затем добавьте 0,112 микролитров 80 нанограмм на миллилитр нигерицин раствора, чтобы отменить градиент рН через митохондриальную внутреннюю мембрану.
Запись дыхания в течение двух-пяти минут и обратите внимание на значение потребления кислорода, когда он становится постоянным. Добавьте пять микролитров 10 миллимолярный метилтрифенилфосфоний раствор для митохондриальной инкубации, чтобы начать подготовку стандартной кривой. Повторите это дополнение четыре дополнительных раза до общей концентрации 2,5.
добавлен микромолар. После этого добавьте пять микролитров одного молярного раствора для инициирования дыхания. Завехать дыхание до тех пор, пока не будет достигнут стабильный след.
Затем добавьте малонат для титрование системы, как указано в текстовом протоколе. В этом исследовании, RCR и протонной утечки кинетики измеряются в молоке голштинской молочной коровы 70 дней после молочных коров кормили с различными уровнями меди, цинка и марганца в течение 28 дней. Состояние IV дыхание считается самым высоким среди коров, учитывая низкий уровень марганца, но является самым низким в контроле коров, что свидетельствует о том, что марганец играет важную роль в минимизации протонной утечки зависимого дыхания.
Анализ печеночного протонного протонного зависимых дыхания показывает, что это дыхание является наибольшим у коров, обработанных низким содержанием марганца, и самым низким в управлении коров. Эти результаты подтверждают, что группа с низким содержанием марганца имеет наибольшее состояние IV дыхания, в то время как контрольная группа имеет самый низкий. В то время как эффективность кормов выше в Ангусе управляет родился от низких быков RFI, чем высокие быки RFI, это не нашло отражения в митохондриальной RCR или кинетики утечки протона.
При выполнении этой процедуры важно держать все флаконы и стаканы на льду при обработке митохондрий. После своего развития этот метод проложил путь для исследователей в области молочного питания, чтобы исследовать роль эффективности митохондрий в эффективности кормов и митохондриальной функции в печени. Не забывайте, что работа с ротеноном может быть опасной, и такие меры предосторожности, как ношение перчаток, защита глаз и надлежащего СИЗ всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
