Nossa pesquisa ou pesquisa principal se concentra na diversidade microbiana, filogenômica e aplicações de fermentação, enfatizando a diversidade de leveduras, adaptações e, especificamente, na aplicação industrial da biologia de leveduras. Especificamente para essas aplicações, estudamos a eficiência da fermentação, a produção de sabor e a tolerância ao estresse em leveduras. Portanto, nossos avanços mais recentes estão relacionados à filogenômica de leveduras, particularmente da Patagônia.
Em seguida, usamos isso para gerar uma nova levedura lager para fermentação de cerveja, mas também estamos usando uma nova levedura para cerveja com baixo teor alcoólico. Ao todo, usamos diferentes técnicas ômicas e evolução experimental para desenvolver esta nova levedura para aplicações biogenológicas. Atualmente, estamos usando diferentes técnicas, como sequenciamento do genoma, sequenciamento do genoma de leitura longa e também transcriptômica.
Então, juntos, usamos essas informações para fazer alguma evolução experimental das diferentes cepas que temos, e então tentamos validar algumas das mudanças genômicas usando técnicas CRISPR ou diferentes técnicas de transformação de leveduras, e dessa forma entramos nos detalhes moleculares da adaptação da levedura a ambientes fermentativos. Portanto, temos dois grandes desafios. Uma é gerar uma nova levedura lager com fermentação eficiente da cerveja, e outra é o oposto.
Queremos obter novas cepas, principalmente da Patagônia, que sejam capazes de gerar cerveja com baixo teor alcoólico. Gostaria de destacar dois resultados principais do nosso laboratório. Uma delas é que identificamos uma origem fora da Patagônia da mãe da levedura lager, Saccharomyces eubayanus.
E agora também geramos dezenas de novos híbridos de cerveja para fermentação de cerveja. Acho que essas são as duas principais descobertas de nossa pesquisa. Para começar, escolha uma amostra de um adesivo de cepa de levedura transformada e inocule-a em um meio peptona de levedura contendo 5% de glicose e 200 micromolares de higromicina.
Incube a cultura a 25 graus Celsius sem agitar por 24 horas. Refresque as culturas em meio fresco em uma diluição de 1 a 10 antes de incubar por mais 24 horas. Lave as células com meio peptona de levedura sem açúcar e, em seguida, inocule-as no meio de teste em uma diluição de 1 a 10.
Suplementar o meio de ensaio com luciferina até uma concentração final de 3 milimolares e com higromicina 200 micromolar para manter a estabilidade do plasmídeo. Para testes de crescimento de açúcar misto, use uma matriz de glicose-maltose com concentrações crescentes de glicose e maltose em meio peptona de levedura. Dispense 200 microlitros de cultura em cada poço de uma placa de 96 poços.
Agora use um leitor de placas de luminômetro para medir a luminescência e a densidade óptica a 620 nanômetros a cada 30 minutos por 72 horas. Defina o tempo de integração para um segundo e desative a atenuação para garantir a atividade contínua do repórter e o monitoramento da densidade celular. Para amostragem de fermentação e monitoramento de luminescência, primeiro dissolva o extrato de malte em água para preparar o meio de extrato de malte.
Cepas de levedura transformadas em pré-cultura em 5 mililitros de meio YPD a 20 graus Celsius com agitação a 200 RPM por 24 horas. Transfira a pré-cultura para 50 mililitros de meio de extrato de malte e incube a 20 graus Celsius com agitação a 200 rotações por minuto por mais 24 horas. Centrifugar a cultura a 21 380 g durante um minuto à temperatura ambiente para colher as células.
Em seguida, ressuspenda as células em uma placa de 12 graus de meio de extrato de malte em triplicados para microfermentações de 50 mililitros. Complemente o meio com 0,3 miligramas por litro de cloreto de zinco para melhorar o desempenho da fermentação. Calcule o volume do inóculo para garantir densidades celulares consistentes entre as réplicas.
Inocular o meio preparado com a quantidade calculada de inóculo. Em seguida, coloque as culturas a 20 graus Celsius sem agitar por 14 dias. Monitore o progresso da fermentação registrando o dióxido de carbono perdido diariamente.
Pese os recipientes todos os dias para medir a perda de peso cumulativa como um indicador da produção de dióxido de carbono. Para monitoramento de luminescência, amostre periodicamente 200 microlitros de cada microfermentação. Adicione luciferina para atingir uma concentração final de 3 milimolares.
Meça a luminescência e a densidade óptica em 620 nanômetros usando um leitor de placas de luminômetro sem atenuação e um segundo de tempo de integração. O plasmídeo repórter epissomal pRS426-PMAL32-LUC-HphMX foi construído com sucesso com o promotor PMAL32 luciferase ORF e hphMX. A atividade diferencial da luciferase foi observada entre as três cepas transformadas sob concentrações variáveis de glicose e maltose.
CBS12357T e CL467.1 mostraram ativação sem glicose, enquanto QC18 exigiu concentração de glicose acima de 1% para ativação. Sob condições de microfermentação, todas as três cepas transformadas demonstraram forte luminescência com pico em momentos diferentes. A luminescência estava ausente nas cepas do tipo selvagem.
