Minha pesquisa de doutorado está focada no estudo de proteínas que são secretadas por bactérias. Eu quero entender especificamente se algumas dessas proteínas secretadas são importantes para causar infecções humanas. Um grande desafio no trabalho com bactérias clínicas recentemente isoladas é sua resistência a antibióticos, o que dificulta as técnicas de genética molecular que dependem da seleção de antibióticos, como deleções de genes e complementação genética.
Este protocolo de clonagem é mais rápido e econômico, pois o IVA elimina a necessidade de enzimas especializadas e reações enzimáticas sequenciais para montagem de plasmídeos antes da transformação de E.coli. Para começar, inicie um software especializado de análise de DNA em um sistema de computador. Monte artificialmente o plasmídeo desejado.
Em seguida, projete primers que se liguem a cada fragmento de DNA. Combine o DNA isolado usando kits comerciais com os primers contendo DNA homólogo em um tubo de PCR. Em seguida, amplifique o DNA com uma execução de PCR.
Quando a reação de PCR estiver concluída, pipetar uma alíquota de dois microlitros. Combine-o com tinta de carregamento. Realize eletroforese em gel de agarose em um gel de agarose a 1% para separar os fragmentos de DNA.
Em seguida, use um iluminador ultravioleta ou LED trans para visualizar os fragmentos. Em seguida, adicione um microlitro de DpnI diretamente ao tubo de reação de PCR para remover o DNA molde metilado. Incube a reação a 37 graus Celsius por 15 minutos ou durante a noite.
Com um kit de purificação de ácido nucleico, remova enzimas residuais, sais, dímeros de primer e produtos de DNA de baixo peso molecular. Quantificar a concentração de ADN dos fragmentos purificados utilizando espectrofotometria. Obtenha DNA de plasmídeo amplificado puro.
Calcule a quantidade de plasmídeo e insira o DNA necessário para cada reação de montagem in vivo. Agora, combine os volumes calculados de plasmídeo e insira o DNA em um tubo de microcentrífuga pré-resfriado de 1,5 mililitro. Coloque o tubo no gelo.
Em seguida, pipete 25 a 100 microlitros de Escherichia coli descongelada e quimicamente competente em um tubo. Transfira a mistura de DNA para a alíquota. Para realizar a transformação por choque térmico, primeiro incube a mistura de E.coli e DNA no gelo por 30 minutos.
Transfira o tubo para um banho-maria a 42 graus Celsius por um minuto. Em seguida, transfira-o de volta para o gelo por dois minutos. Transfira assepticamente o meio LB para o tubo para completar o volume para um mililitro.
Transfira a mistura de um mililitro para um tubo de cultura de vidro. Em seguida, coloque-o em uma incubadora agitada para recuperação e produção do marcador de seleção de antibióticos codificado por plasmídeo. Após a recuperação, deposite cerca de 100 a 1.000 microlitros da reação de transformação em meios de seleção sólidos.
Use um espalhador de células estéril para dispersar a alíquota pela placa de cultura do sem-fim. Centrifugar as células transformadas restantes a 13.000 G por um minuto. Em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 100 microlitros de meio estéril.
Deposite as células ressuspensas em meios de seleção sólidos, conforme demonstrado anteriormente. Em seguida, inverta as placas de cultura. Coloque-os em uma incubadora durante a noite a 37 graus Celsius.
Remova as placas de cultura contendo culturas de E.coli transformadas da incubadora. Conte as colônias diretamente para enumerar. Transferir meios de crescimento estéreis suplementados com antibióticos apropriados para tubos de cultura estéreis.
Com um loop de transferência estéril, pegue uma colônia e inocule as células no meio de cultura. Incube os tubos de cultura em uma incubadora agitada. No dia seguinte, isole o DNA do plasmídeo das culturas bacterianas usando um kit de isolamento de plasmídeo disponível comercialmente.
Para determinar se os plasmídeos estão montados corretamente, use espectrofotometria para quantificar a concentração de DNA. Pipetar uma alíquota de 50 a 150 nanogramas de ADN plasmidial para uma reacção diagnóstica de digestão por restrição. Adicione enzimas de restrição selecionadas com base em seus locais de clivagem esperados no DNA do plasmídeo.
Quando a reação de restrição estiver completa, adicione corante de carregamento ao tubo. Carregue toda a mistura em um gel de agarose a 1% e execute uma corrida eletroforética. Após a corrida, visualize os fragmentos de DNA com um iluminador trans UV ou LED para comparação com o último.
A digestão enzimática de dois clones de plasmídeo isolados resultou em um único produto de DNA de 2,3 pares de quilobases para o clone de plasmídeo 1, indicando que este é apenas o PSU 19. A clivagem simples do clone de plasmídeo 2 resultou em um único produto de DNA de três pares de quilobases e dois produtos de DNA de 2,3 pares de quilobases e 770 pares de quilobases após clivagem dupla.
