O foco da pesquisa de longo prazo é encontrar terapias potenciais para distúrbios neurológicos na síndrome de Down. E nosso foco atual é a neurogênese prejudicada pela síndrome de Down, uma das principais causas de deficiência intelectual. Descobrimos que a neurogênese prejudicada pela síndrome de Down é causada por defeito do ciclo celular bifásico, ao contrário da crença popular de que é apenas devido à senescência das células progenitoras neurais da síndrome de Down.
A identificação do defeito do ciclo celular bifásico usando o protocolo baseado em IPSC humano descrito neste manuscrito conduzirá estratégias terapêuticas potenciais de desenvolvimento, considerando tanto o estado do ciclo celular que é a proliferação reduzida na fase inicial quanto a falha em sair do ciclo celular na fase tardia. Para começar, adicione 10 micromolares de inibidor de rocha no meio completo do iPCS humano, DPBS, solução de descolamento celular e meio condicionado por alimentador suplementado com 25 nanogramas por mililitro de fator de crescimento básico de fibroblastos. Aqueça todos os reagentes a 37 graus Celsius.
Pegue uma placa de seis poços de iPSCs nos alimentadores. Pipetar as colónias diferenciadas e adicionar meio iPSC humano completo e fresco. Coloque a placa a 37 graus Celsius na incubadora de dióxido de carbono por duas horas.
Após a incubação, lave os poços uma vez com DPBS sem cálcio e magnésio. Em seguida, adicione um mililitro de solução de descolamento celular a cada poço. Coloque a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono por 12 a 14 minutos.
Observe as células sob um microscópio invertido. Se a maioria das células estiver se desprendendo, mas se algumas permanecerem aderidas, bata suavemente na placa pelos lados. Adicione três mililitros de DPBS suplementados com cálcio e magnésio em cada poço para diluir a solução de descolamento celular.
Com uma pipeta de cinco mililitros, faça uma pipetagem suave duas a três vezes para quebrar os grumos, evitando bolhas. Passe as células por um filtro de 40 micrômetros para uma centrífuga de 50 mililitros 2. Centrifugar a suspensão à temperatura ambiente durante cinco minutos a 200 G.Utilizar um sistema de aspiração a vácuo para aspirar suavemente o meio.
Agora, ressuspenda as células em 10 mililitros de meio iPSC humano. Transfira todas as células em suspensão para um prato de 15 centímetros revestido com gelatina 0,1% e incube em uma incubadora de dióxido de carbono. Recolha os meios com células para uma centrífuga 2.
Centrifugue à temperatura ambiente durante cinco minutos a 200 G. Em seguida, aspire suavemente o meio com o sistema de aspiração a vácuo. Ressuspenda as células em um mililitro de meio condicionado por alimentador, suplementado com 25 nanogramas por mililitro de BFGF e 10 micromolares de inibidor de rocha. Após a contagem das células, preparar uma suspensão de 30 000 a 50 000 células por mililitro.
Semeie a suspensão em uma placa de poço. Após dois dias, substitua o meio condicionado pelo alimentador por uma célula progenitora neural ou meio NPC. Mude a mídia nos dias dois e 18, conforme indicado.
No dia 28, substitua o meio na placa por meio NPC suplementado com 10 micromolares de inibidor de rocha. Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono por duas horas. Após a incubação, aspire o sobrenadante e lave os poços uma vez com DPBS sem cálcio e magnésio.
Adicione um mililitro de solução de descolamento de células em cada poço. Em seguida, observe as células sob um microscópio invertido com ampliação de 4x. Em seguida, pipete três mililitros de DPBS suplementado com cálcio e magnésio em cada poço da placa.
Com uma pipeta de cinco mililitros, pipete suavemente a suspensão e quebre os grumos. Coe a suspensão celular através de um filtro de 40 micrômetros colocado sobre uma centrífuga de 50 mililitros 2. Centrifugue e aspire conforme demonstrado anteriormente e, em seguida, ressuspenda o pellet em um mililitro de meio de diferenciação definido suplementado com B 27 com vitamina A. Conte as células vivas usando azul de tripano e um hemocitômetro.
Em seguida, semeie 50.000 células em cada poço de uma placa de 48 poços revestida com matriz qualificada. No dia 33, substitua o meio nos poços de cultura por meio de diferenciação neural. Uma redução significativa nos neurônios positivos para TUBB3 foi observada em culturas com síndrome de Down, em comparação com células euplóides isogênicas, com uma diminuição de aproximadamente duas vezes evidente no dia 85.
Uma proporção significativamente menor de células positivas para KI67 foi observada em culturas com síndrome de Down durante o estágio neurogênico inicial, em comparação com células euplóides isogênicas, mostrando uma redução de aproximadamente quatro vezes. No estágio neurogênico tardio, a maioria das células euplóides isogênicas saiu do ciclo celular com coloração mínima de KI67, enquanto a maioria das células da síndrome de Down permaneceu positiva para KI67, mostrando um aumento de cinco vezes. Um segundo par de iPSCs humanas euplóides isogênicas confirmou níveis reduzidos de neurônios positivos para TUBB3 e células progenitoras neurais positivas para PAX6 elevadas em culturas de síndrome de Down no final da diferenciação neural, com uma redução de duas vezes nos neurônios positivos para TUBB3 e um aumento de mais de duas vezes nas células positivas para PAX6.
