A barreira hemato-medular é firmemente ligada e tem permeabilidade limitada. Esse protocolo permite que os pesquisadores abram com segurança e transitoriedade a barreira hematoespinhal, usando microbolhas e ultrassom focado. Essa técnica permite que a abertura da barreira hematoespinhal seja localizada no segmento da medula espinhal alvo.
Além disso, a interrupção pode ser facilmente confirmada por observação visual ou microscopia fluorescente. Este protocolo pode ser explorado por seu potencial em melhorar a entrega de terapias gênicas, ou drogas para a medula espinhal para o tratamento de tumores, atrofia ou lesão. Quem vai demonstrar o procedimento será Meghana Bhimreddy.
Um estudante de MD estelar do meu laboratório, que diariamente faz a ponte entre engenharia e medicina. Para começar, adquira um sistema de transdutor de ultrassom focado com especificações suficientes para alcançar a barreira hemato-medula espinhal, ou aberturas BSCB em ratos. Afixe o suporte de sonda impresso em 3D e o cone de água no transdutor.
Verifique se há uma vedação estanque entre o cone e o transdutor. Fixe a membrana de poliéster esterilizada, de 50 mícrons de espessura, acusticamente transparente, no fundo do cone de água usando um elástico. Encha o cone de água com água desgaseificada e deionizada usando os tubos de entrada e saída.
Evite bolhas de ar dentro do cone, pois elas podem interromper o acoplamento acústico entre o transdutor e o alvo. Nesta fase, a membrana de Mylar deve ser ligeiramente inflada. Conecte o equipamento de acionamento que contém o gerador de ondas e o amplificador de acionamento de radiofrequência ao transdutor.
Fixe o braço estereotáxico na placa de fixação e prenda o suporte da sonda ao braço. Registrar o peso de uma rata Sprague-Dawley anestesiada e realizar um teste de pinça dos dedos dos pés e da cauda para confirmar a anestesia. Coloque uma almofada de aquecimento e uma almofada absorvente estéril na placa de fixação.
Posicione o rato sobre a almofada absorvente. Aplique pomada ocular e coloque um termômetro retal para monitorar a temperatura corporal. Palpar a última costela do rato, que está presa à coluna vertebral na 13ª vértebra torácica.
Use uma navalha elétrica para raspar o pelo da superfície dorsal entre a última costela e o pescoço. Limpe a pele exposta com gaze mergulhada em iodopovidona a 10%. Criar uma incisão mediana com tesoura de íris e dissecar através da fáscia até que os processos espinhosos e a lâmina estejam expostos.
Remova o osso com pinças ósseas offset e tesoura de íris de lâmina angulada, até que a medula espinhal fique exposta. Fixe o rato à placa de fixação apertando os processos espinhosos adjacentes à laminectomia. Em seguida, puxe levemente as braçadeiras para deixar a coluna tensa.
Ajustar a posição do transdutor com o braço estereotáxico até que ele esteja localizado exatamente acima da laminectomia. Afixar o aparelho laser no fundo do cone de água e baixá-lo até que o ponto laser esteja visível. Em seguida, ajuste a posição lateral do transdutor até que o ponto laser esteja acima do local alvo para a ruptura da BSCB.
Remova o aparelho de laser e preencha o espaço entre o cone e a medula espinhal com gel de ultrassom desgaseificado, sem introduzir bolhas de ar. Defina os parâmetros para sonicação na saída de energia do transdutor. Prepare uma solução de microbolhas de acordo com as instruções do fabricante.
Para aumentar as chances de sucesso do cateterismo da veia caudal, mergulhe a cauda em água morna e coloque um torniquete na base da cauda para aumentar o diâmetro das veias. Em seguida, insira um cateter venoso caudal calibre 22 e lave com 0,2 mililitros de soro fisiológico heparinizado. Injete um mililitro por quilograma de corante azul de 3% ou EBD no cateter.
Em seguida, lave o cateter com 0,2 mililitros de solução salina heparinizada. Confirme o cateterismo bem-sucedido da veia caudal verificando se há alteração de cor azul na pele, nos olhos ou na veia espinhal dorsal do rato. Injetar 0,2 mililitros em bolus de microbolhas no cateter e lavar com soro fisiológico heparinizado antes de iniciar a sonicação.
Após a eutanásia do rato, remova a medula espinhal e coloque-a em paraformaldeído a 4% a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, substitua o paraformaldeído por PBS. Para visualizar a interrupção do BSCB, isole uma seção de dois centímetros ao redor do local da sonicação, usando uma lâmina de barbear.
Dividir o corte em cortes de 10 mícrons de espessura usando micrótomo e corar com coloração de hematoxilina eosina. Para microscopia de fluorescência, desparafinizar a lâmina contendo o corte da medula espinhal e contramanchar com 25 microlitros de DAPI dissolvidos no meio de montagem. Incubar as seções a quatro graus Celsius por 10 minutos no escuro para evitar o clareamento.
Após a incubação, use um microscópio fluorescente para obter imagens de todas as lâminas. Imagem da lâmina corada pela hematoxilina e eosina usando um microscópio de luz. A vasculatura medular é visível após laminectomia e mostra a veia espinhal posterior, com múltiplos vasos menores irradiando lateralmente.
Após a injeção intravenosa de EBD, o tecido circundante e a vasculatura medular pareciam azuis. Após a sonicação, uma mancha azul torna-se visível sobre o local alvo, indicando o extravasamento de EBD para o parênquima branco, devido à ruptura da BSCB. A excisão da medula espinhal dos ratos com ultrassom focado de baixa intensidade, ou sonicação com LIFU, confirmou o aparente extravasamento da EBD para a medula espinhal.
Enquanto os ratos controlados negativos sem tratamento com LIFU não mostraram extravasamento de EBD. As medulas, com sonicação por LIFU, apresentaram intensidade significativamente maior de autofluorescência da EBD, do que as medulas, que não receberam sonicação. Com intensidades semelhantes de DAPI presentes em ambos.
A análise da hematoxilina e eosina não revelou dano neuronal, hemorragia ou lesões cavitárias nos locais sonicados. Exemplos de cordas lesionadas devido ao mau manuseio cirúrgico e sonicação de alta potência são mostrados como comparação. Nos ratos que receberam microbolhas e tratamento com LIFU, não foi observada alteração nos escores motores, pré-sonicação, pós-sonicação e durante um período de sobrevivência de cinco dias.
Mínimas alterações na temperatura medular foram observadas antes, durante e após a análise da sonicação. É importante limitar o dano cirúrgico ao cordão durante a laminectomia. A visualização dos cortes corados em H e E com microscopia, indicará se ocorreu algum dano.
Após a ruptura da barreira hemato-espinhal, usando ultrassom de foco, os animais podem ser injetados com agentes antineoplásicos ou terapias gênicas. O resultado determinará se esta técnica pode melhorar a entrega de terapêutica e estender a sobrevivência no contexto da patologia da medula espinhal.
