Esse protocolo permitiu a detecção contínua de efeitos transitórios na forma de algumas alterações morfológicas durante uma infecção viral, como descolamento e flutuação de células aderentes. Este protocolo permitiu uma abordagem não-invasiva e não-trabalhosa intensiva para monitorar continuamente as alterações morfológicas celulares e capturar efeitos transitórios como vazamento vascular que poderiam ser perdidos pelo ensaio final. Este protocolo pode ser utilizado para analisar alterações na integridade vascular de outras linhagens celulares em diferentes arranjos experimentais se as células forem aderentes.
Depois de preparar os HUVECs, inicie o aplicativo de software RTCA clicando duas vezes no ícone na área de trabalho. Digite o nome de usuário e a senha na janela de login. Coloque uma placa resistora RTCA de 96 poços com o poço A1 voltado para dentro na estação RTCA localizada na incubadora de cultura celular.
Em seguida, vá para a guia de notas do experimento do software RTCA e digite o nome do experimento, o número de série do dispositivo e o tipo de dispositivo. Na guia layout sob a guia célula do software RTCA, realce todos os poços e clique com o botão direito do mouse nos poços destacados para garantir que todos os poços estejam ligados. Em seguida, abra a guia de agendamento do software RTCA.
Clique em Step_1 e defina varreduras como 10 e intervalo como 30 segundos. Em seguida, clique em iniciar continuar no canto superior esquerdo do software para iniciar a execução da verificação. Após a execução, abra a guia índice de célula para verificar os dados.
Todos os valores do índice celular devem ser menores que 0,063. Em seguida, verifique os dados brutos de varredura na parte inferior da guia de índice de célula para padrões de valores repetidos, conforme descrito no manuscrito. Para concluir a execução de verificação, clique em chapa e selecione placa de liberação.
Remova a placa resistora RTCA de 96 poços da estação RTCA. Para obter a leitura de fundo no RTCA, lave a placa de microeletrodo de ouro especializada revestida de colágeno tipo um duas vezes com 60 microlitros por poço de HBSS. Descarte o HBSS restante e adicione 50 mililitros por poço de matriz extracelular.
Em seguida, coloque a placa na estação RTCA localizada na incubadora de cultura de células com o poço A1 voltado para dentro. Na guia notas exp do software RTCA, digite o nome do experimento, o número de série do dispositivo e o tipo de dispositivo. Navegue até a guia célula do software RTCA e selecione a guia layout.
Destaque os poços a serem utilizados e clique com o botão direito do mouse nos poços destacados para garantir que todos os poços estejam ligados. Agora vá para a aba de agendamento do software RTCA. Clique em Step_1 e clique em iniciar ou continuar no canto superior esquerdo para obter uma leitura de plano de fundo.
A placa já está pronta para a semeadura e remoção das células da estação RTCA. Em seguida, semeamos de 10 a quartas células por poço de HUVECs na placa de microeletrodo de ouro com 50 microlitros por poço de meio condicionado. Coloque a placa de volta na estação RTCA localizada na incubadora de cultura celular, com o poço A1 voltado para dentro.
Em seguida, na guia de programação do software, clique em adicionar uma etapa no canto superior esquerdo. Clique em Step_2. Altere as varreduras para 601, o intervalo para dois minutos e clique em aplicar.
Clique em Step_2 e clique em iniciar ou continuar no canto superior esquerdo do software. Após 20 horas de incubação, quando os valores do índice celular na guia do gráfico do poço mostram um platô, a placa está pronta para a infecção. Na guia agendamento do software RTCA, clique em etapa de anulação.
A placa já está pronta para ser retirada da estação RTCA. Para infectar os HUVECs, recupere o estoque de vírus Zika do freezer de 80 graus Celsius negativos. Diluir o estoque do vírus Zika com matriz extracelular livre de soro em tubos de centrífuga de 1,5 mililitro para atingir multiplicidades de infecção de 0,1 e um.
Em seguida, descarte o meio condicionado de cada poço e enxágue cada poço com 60 microlitros de HBSS enquanto usa a lateral do poço. Adicione 40 microlitros de amostra de vírus diluída no poço, começando da maior para a menor diluição, usando o lado do poço. Incubar a placa em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono para permitir a absorção do vírus.
Gire a placa cinco vezes a cada 15 minutos para permitir a absorção do vírus em toda a monocamada celular. Após uma hora de incubação, remova e descarte a suspensão do vírus da menor concentração para a mais alta. Lave as células infectadas duas vezes com 60 mililitros de HBSS.
Sobrepor os poços com matriz extracelular suplementada com SFB a 2%. Para os poços de controle positivo, diluir a trombina em 20 unidades por mililitro com matriz extracelular suplementada com SFB a 2% e sobrepor os poços com trombina contendo meio de matriz extracelular, utilizando o lado do poço. Agora clique na guia agendar e adicione uma etapa no canto superior esquerdo.
Navegue até Step_3 e modifique as varreduras para 3, 601 e o intervalo para dois minutos. Clique em aplicar e, em seguida, clique em OK na janela exibida. Coloque a placa de microeletrodo de ouro especializado infectado com o poço A1 voltado para dentro na estação RTCA localizada na incubadora de cultura.
Finalmente, clique em Step_3 e clique em iniciar continuar no canto superior esquerdo do software. O valor do índice celular de HUVECs infectados com o vírus Zika P6-740 em uma multiplicidade de infecção de 0,1 começou a cair em 15 horas após a infecção, em comparação com o controle de infecção negativo. Os HUVECs infectados com uma dose mais alta do vírus Zika P6-740 em uma multiplicidade de infecção de um mostraram uma queda no índice celular em 11 horas após a infecção.
Nas 24 horas pós-infecção, houve uma queda de 5% e 7% no valor do índice celular normalizado quando as células endoteliais foram infectadas em uma multiplicidade de infecção de 0,1 e um, respectivamente. Uma redução de 50% no valor do índice celular normalizado foi registrada em 96 horas pós-infecção e 66,75 horas pós-infecção após a infecção em uma multiplicidade de infecção de 0,1 e um, respectivamente. O valor do índice celular normalizado atingiu seu ponto mais baixo em 107 horas após a infecção, com uma redução de 51% e 60% após a infecção em uma multiplicidade de infecção de 0,1 e um, respectivamente.
O valor normalizado do índice celular apresentou um aumento de 4% e 13% a partir de 107 horas após a infecção até o final do experimento às 168 horas após a infecção. Antes de cada experimento RTCA, uma corrida de verificação do resistor usando a placa RTCA de 96 poços é essencial para garantir que cada biossensor funcione bem para produzir valores confiáveis de índice celular.
