Avaliação da integridade da barreira intestinal em camundongos usando Dextrano marcado com fluoresceína-isotiocianato

Este método ajuda a responder a perguntas sobre se uma condição altera a integridade da barreira intestinal ou questões sobre se um tratamento potencial pode manter a integridade da barreira intestinal. A principal vantagem dessa técnica é que ela oferece uma técnica não invasiva e de baixa carga para avaliar e quantificar a permeabilidade intestinal in vivo. Para começar, jejue os camundongos por quatro horas e, em seguida, administre 200 microlitros da suspensão FITC-dextran via gavagem oral a cada camundongo usando uma agulha de gavagem curva esterilizada de calibre 22 de 38 milímetros.

Inicie um temporizador após a primeira gavagem e aguarde de cinco a 10 minutos entre cada gavagem para permitir medições in vivo, mantendo uma hora após a gavagem. Mantenha a suspensão FITC-dextran restante para a curva padrão. Inicie a máquina e o software clicando e segurando o botão Iniciar e permita que o sistema aqueça.

Clique em Status do dispositivo e verifique se todos os dispositivos configurados mostram OK antes de prosseguir. Em seguida, clique em Novo estudo e salve o arquivo com o nome desejado. Em seguida, clique em Opções de estudo.

Insira o ID da amostra e escolha o laser correto e experimente. Em seguida, remova a pele da área abdominal usando um barbeador elétrico e aplique pomada veterinária generosamente nos olhos para evitar a secagem. Abra a câmara de imagem e coloque o animal dorsalmente na placa de varredura.

Em seguida, prenda os membros e a cauda com fita adesiva. Em seguida, selecione a área a ser digitalizada usando a ferramenta Desenhar. Certifique-se de incluir toda a largura do abdômen desde logo acima do fígado até o reto.

Em seguida, clique na ferramenta Modificar para ajustar a área uma vez desenhada. Defina a resolução da varredura para 2,0 milímetros e clique em Iniciar para iniciar a varredura. Em seguida, abra os arquivos de imagem localizando-os sob o nome de arquivo escolhido e, simultaneamente, abra todos os arquivos com configurações sincronizadas.

Usando a barra de ferramentas de configurações de imagem, use os botões Sincronizar imagem e Sincronizar escala para sincronizar as configurações de imagem para uma comparação precisa. Em seguida, salve as imagens com as escalas ajustadas. Comparar a fluorescência abdominal de cada animal e do camundongo controle em imagens uniformemente dimensionadas usando software associado ao sistema de imagem.

Recolher um pellet fecal de cada rato num tubo estéril quatro horas após a gavagem. Em seguida, mantenha os tubos no gelo e coloque-os no escuro. Em seguida, centrifugar as amostras de sangue a 9,390 x g por 10 minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, transfira o plasma para um novo tubo estéril e mantenha-o no gelo no escuro. Diluir 50 miligramas de amostras fecais em 200 microlitros de PBS e diluir o plasma com PBS numa proporção de um para dois. Placa de 100 microlitros amostras e padrões em uma placa preta opaca de 96 poços.

Leia a fluorescência em um leitor de placas fluorescentes com excitação a 485 nanômetros e absorção a 530 nanômetros. Finalmente, determine a concentração de FITC-dextran por amostra, comparando a fluorescência com as concentrações conhecidas da curva padrão. A análise da fluorescência in vivo mostrou que os ratos que receberam apenas a dieta controle tiveram uma maior ingestão hepática de FITC-dextran e maiores níveis de fluorescência residual na cavidade abdominal em comparação com os ratos que receberam a dieta suplementada com inulina.

Os ratos que receberam a dieta suplementada com inulina tiveram níveis significativamente mais baixos de FITC-dextran em seu plasma em comparação com os ratos que receberam apenas a dieta de controle. Concordantemente, os ratos que receberam a dieta de inulina tiveram níveis significativamente mais elevados de FITC-dextran em suas fezes do que os ratos que receberam apenas a dieta de controle. Os níveis mais baixos de FITC-dextran nas fezes dos camundongos controlados indicam que ele permeou através da barreira intestinal para a circulação em vez de ser excretado adequadamente.

Os altos níveis de FITC-dextran no plasma reforçaram esse achado. O tempo é essencial ao tentar este procedimento. A leitura por fluorescência e a coleta de amostras devem ocorrer o mais próximo possível de uma hora e quatro horas após a gavagem para cada camundongo individual.