Nosso protocolo fornece um método suave de inoculação e extração de plantas que permite recuperar populações bacterianas cultivadas no apoplasto foliar adequado para análise de expressão gênica de célula única, como citometria de fluxo. Este método permite a extração de uma quantidade considerável de bactérias do apoplasto sem contaminar significativamente as amostras com restos celulares vegetais. Este método otimizado para a recuperação de bactérias apoplásticas pode ser aplicado diretamente ou com pequenas modificações a uma série de sistemas bacterianos vegetais que compreendem bactérias fitopatogênicas ou bactérias endocíticas benéficas.
Quem demonstrará o procedimento será Nieves Lopez-Pagan, estudante de doutorado do nosso laboratório. Para começar, encha um vaso de 10 centímetros de diâmetro com uma mistura de substrato vegetal de vermiculita 1:3 previamente regada. Cubra o vaso com uma malha metálica perfurada e ajuste a malha metálica ao solo úmido usando um elástico.
Em seguida, semeie sementes de Arabidopsis nos orifícios da malha metálica com um palito molhado. Coloque de três a quatro sementes em posições distantes dentro do vaso. Cubra o vaso com uma cúpula de plástico para manter a umidade relativa alta e incube para estratificação a quatro graus Celsius por 72 horas.
Transfira o vaso para uma câmara de crescimento de plantas em condições de dias curtos. Para descobrir a panela, retire a cúpula de plástico. Uma vez germinadas as sementes, utilizar a pinça para retirar a maior parte das mudas, mantendo uma muda em cada uma das posições do vaso.
Em seguida, prepare as plantas de feijão Phaseolus vulgaris cobrindo o fundo de uma placa de Petri com um pedaço de papel toalha molhado e colocando as sementes de feijão por cima. Sele a placa de Petri com fita cirúrgica e incube a 28 graus Celsius por três a quatro dias. Transfira as sementes germinadas para um vaso de 10 centímetros de diâmetro preenchido com substrato úmido de vermiculita 1:3 e incube em uma câmara de crescimento de plantas em ambientes de dias longos.
Coloque o estoque de glicerol da cepa de interesse de Pseudomonas syringae de menos 80 graus Celsius em uma placa de LB suplementada com os antibióticos apropriados. Incubar a placa a 28 graus Celsius por 40 a 48 horas. Raspar a biomassa bacteriana e ressuspendê-la em cinco mililitros de cloreto de magnésio 10-milimolar.
Meça a densidade óptica a 600 nanômetros e ajuste-a para 0,1 adicionando cloreto de magnésio de 10 milimolares. Realizar diluições seriadas em cloreto de magnésio de 10 milimolares para obter uma concentração final de inóculo de cinco vezes 10 a quinta UFC por mililitro. Em seguida, prepare 200 mililitros de inóculo para as plantas de Arabidopsis e 50 mililitros para as plantas de feijão.
Antes da inoculação, adicionar o tensoativo Silwet L-77 a uma concentração final de 0,02% para a inoculação do feijão e 0,01% para Arabidopsis. Para a infiltração de Arabidopsis, coloque dois palitos de madeira formando um X sobre o vaso e coloque o vaso virado para baixo sobre uma placa de Petri de 14 centímetros de diâmetro contendo 200 mililitros de inóculo. Para a inoculação das folhas de feijão, insira as plantas e a solução de inóculo em uma câmara de vácuo e introduza a folha em um tubo de centrífuga cônica de 50 mililitros contendo o inóculo.
Dê um pulso de 500 milibares por 30 segundos para se infiltrar nas folhas. Escorra o excesso de solução de inóculo com um pedaço de papel e devolva os planos à câmara de crescimento correspondente. Quatro dias após a inoculação, corte a parte aérea da planta Arabidopsis ou a folha inoculada da planta de feijão e coloque-a em uma seringa de 20 mililitros sem agulha.
Para folhas de feijão, enrole a folha sobre si mesma, deixando a face abaxial para fora. Adicione volume suficiente de água destilada para cobrir o tecido. Em seguida, insira o êmbolo segurando a seringa na posição vertical e remova o excesso de ar e bolhas de ar dentro da seringa, batendo suavemente o barril até que todo o ar esteja localizado perto da ponta e, após remover o ar, cubra a ponta do barril da seringa com filme de parafina.
Agora pressione cuidadosamente o êmbolo para gerar pressão positiva até que o tecido fique mais escuro. Em seguida, puxe o êmbolo para gerar pressão negativa. Remova o filme de parafina e o êmbolo e colete o líquido contendo as bactérias extraídas do apoplasto.
Para uma análise de célula única, prepare uma solução de agarose a 1,5% em água destilada. Depois de derretido, adicione volume suficiente para preencher o espaço entre duas lâminas de microscopia colocadas lado a lado e coloque outra lâmina por cima. Deixe-os dirigir por 15 minutos e remova o slide colocado na parte superior com cuidado.
Usando uma lâmina, corte a almofada de agarose em pedaços de cinco milímetros por cinco milímetros antes de usar. Paralelamente, centrifugar um milímetro das bactérias extraídas do apoplasto. Retire cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta e ressuspenda o pellet em 20 microlitros de água para concentrar as células.
Coloque uma gota de dois microlitros das células concentradas em uma tampa de 0,17 milímetro e cubra a gota com um pedaço de almofada de agarose. Visualize a preparação bacteriana sob o microscópio confocal para identificar bactérias fluorescentes verdes usando lasers específicos. Identifique todas as bactérias usando o campo brilhante e mescle ambos os campos.
Para realizar a análise por citometria de fluxo, pegue uma alíquota das suspensões de bactérias extraídas do apoplasto. Analise usando o citômetro de fluxo e adquira 100.000 eventos. A expressão de hrpL GFP é monitorada por fluorescência de GFP.
Os gráficos de dot plot mostram a distribuição da intensidade de fluorescência da GFP versus o tamanho da célula na população, enquanto os histogramas mostram a intensidade da fluorescência da GFP versus as contagens celulares. As porcentagens de hrpL ON foram maiores do que as porcentagens correspondentes de hrpL OFF. Imagens de microscopia de fluorescência mostram níveis heterogêneos de GFP associados à expressão de hrpL.
As bactérias que apresentam baixa ou nenhuma fluorescência de GFP são observadas. Para obter os melhores resultados, seja gentil durante as etapas de extração de bactérias para evitar danificar o tecido vegetal e, assim, limitar a contaminação do conteúdo celular da planta. As amostras de bactérias obtidas podem ser usadas para outros fins onde a redução da contaminação da planta é uma vantagem, como extrações de ácido nucleico para posterior análise genômica bacteriana ou transcriptômica.
