O protocolo é altamente sensível e permite a captura de alto rendimento do perfil de expressão gênica em resolução de célula única. A técnica fornece especificidade anatômica espacial e molecular em resolução de célula única. Depois de colher o cérebro, selecionar as células individuais e preparar o mRNA, injete fluido da linha de controle no chip qPCR para o priming.
Insira o chip qPCR no dispositivo de mistura microfluídica. Selecione o script Prime e execute o programa. Após a conclusão do programa, remova o chip qPCR preparado e pipete seis microlitros da reação da placa de amostra de PCR para o poço de amostra correspondente no chip de qPCR preparado.
Agora, pipete seis microlitros da reação da placa de ensaio de PCR para o ensaio correspondente bem no chip qPCR preparado. Em seguida, insira o chip no dispositivo de mistura microfluídica. Selecione o script Load Mix e execute o programa.
Ligue a plataforma microfluídica RT-qPCR e aqueça a lâmpada. Remova o chip qPCR do dispositivo de mistura microfluídica e retire o adesivo protetor da parte inferior do chip. Abra a plataforma microfluídica RT-qPCR e carregue o chip qPCR na plataforma.
Inicie o software de coleta de dados clicando em Iniciar uma nova execução. Verifique o código de barras do chip e o tipo de chip. Em seguida, clique em Avançar.
Selecione o arquivo de execução do chip e procure o local do arquivo para o armazenamento de coleta de dados. Em seguida, clique em Tipo de Aplicação e selecione Expressão Gênica. Selecione ROX para uma referência passiva, sonda única e EVAGreen para o tipo de sonda.
Clique para selecionar o programa de ciclo térmico e selecione Biomark HD GE:Fast 96x96 PCR+Melt v2. pcl arquivo. Baixe o software de análise de dados.
Inicie o software para analisar o experimento microfluídico RT-qPCR. Clique em Chip Run e abra o ChipRun. bml que foi criado pelo experimentador.
Uma janela exibindo os detalhes experimentais, incluindo a referência passiva, a sonda e o programa térmico de PCR, aparecerá. Na guia Chip Explorer, clique em Configuração da placa de amostra e crie um novo modelo de placa de amostra. Copie e cole as etiquetas de amostra na planilha do software de acordo com o experimento.
Indicar o nome da amostra e a concentração de ARN utilizada para as amostras-padrão. Agora, mapeie a configuração de exemplo clicando em mapear no menu de tarefas e selecionando SBS96-Left.dsp. Em seguida, selecione Exibições de detalhes para atualizar essas alterações no arquivo e clique em Analisar.
Selecione Configuração da placa do detector e crie uma nova placa de ensaio. Selecione o tipo e o formato de contêiner apropriados. Cole os nomes dos ensaios de acordo com o experimento e clique em Analisar.
No painel de configurações de análise, clique em Usuário e defina o ajuste como automático. Agora, revise manualmente cada reação no chip 96x96. Visualize as curvas de amplificação e fusão para determinar se cada reação seguiu o padrão de qPCR esperado.
Se a amplificação ou a curva de fusão não corresponder ao esperado, falhe essa reação. Após o QC, exporte os dados selecionando o arquivo, clicando em exportar e salvando o conjunto de dados como um arquivo csv. Como o arquivo csv exportado tem uma matriz de falha de passagem e uma matriz com valores de CT brutos, use a matriz de falha de passagem para substituir todas as células com falha no conjunto de dados por NA. Baixe a versão recente do software R de código aberto e, em seguida, baixe o aplicativo R Studio.
Para a centralização da mediana, use o software R para calcular o valor mediano da TC calculado a partir de todos os valores da TC para uma amostra individual e, em seguida, subtraia todos os valores individuais da TC desse valor mediano para obter um valor de TC menos delta. Para a normalização do gene de limpeza, calcule a expressão média dos genes de limpeza para cada amostra e use esse valor para subtrair os valores individuais de TC. Para gerar um valor CT delta delta negativo, execute o código no software R.
Carregue o conjunto de dados normalizado em R e analise os dados usando a função de escala, gere os dados dimensionados e, em seguida, use a função de mapa de calor R ou o software separado para gerar um mapa de calor. Para organizar o conjunto de dados para outras funcionalidades, calcule as correlações de Pearson entre cada gene seguido pela função de fusão. Exporte e carregue esses dados em um software de rede de correlação gênica.
Os neurônios apresentaram expressão elevada de NeuN e as amostras microgliais apresentaram expressão significativa dos marcadores microgliais Cd34 e Cx3xr1. As amostras Th+neuronais demonstraram expressão significativamente elevada de Th em comparação com amostras Th-neuronais e microglia. Os neurônios-Th-exibiram expressão significativa de Gcg, sugerindo que as amostras Th-neuronais são enriquecidas com neurônios que usam Glp1 como neurotransmissor.
A análise discriminatória linear mostrou que esses três tipos de células tinham diferentes perfis de expressão gênica em todos os 65 genes. Os subfenótipos celulares de amostras de neurônios enriquecidos com Glp1 através de uma série temporal de abstinência alcoólica foram representados usando mapas de calor. O subfenótipo A, que expressa altamente o cluster de genes inflamatórios um, aumenta em proporção no ponto de tempo de retirada de oito horas e atinge um máximo de 32 horas de retirada.
O subfenótipo inflamatório é normalizado para controle por 176 horas de abstinência. O subfenótipo B, que expressa altamente o cluster de genes dois do receptor GABA, demonstra uma supressão geral na expressão desse cluster de genes pela condição de abstinência de 176 horas. A expressão gênica de amostras individuais foi combinada em médias para que a expressão de agrupamentos de genes e a localização proteica desse transcrito gênico pudessem ser visualizadas ao longo da série temporal.
Esta técnica pode ser aplicada a qualquer sistema biológico ou tecido para entender a resposta celular a uma doença ou perturbação. Trata-se de decifrar a resposta molecular em resolução de célula única relacionada à arquitetura espacial e anatômica do tecido.
