Neste protocolo JoVE, usamos sequenciamento de RNA unipartidária à base de gotículas para caracterizar a arquitetura biológica dos neurônios simpáticos cardíacos na saúde e na doença. Este método permite o sequenciamento de uma grande coleção de amostras neuronais ao longo de um período de tempo. Ao puxar núcleos com hashtag oligos, este método permite o multiplexing das amostras.
Este método tem o potencial de ser estendido ao sequenciamento de neurônios do gânglio humano, o que tem sido desafiador devido ao seu grande tamanho celular e à difícil coleta simultânea de amostras. Demonstrando o procedimento estará Conny van Munsteren, técnico de pesquisa, e Lieke van Roon, estudantes de doutorado do nosso laboratório Begin coletando todos os materiais necessários para dissecção, em seguida, corrigir o rato no quadro de dissecção. Molhe o mouse com 70% de etanol para minimizar a dispersão da pele.
Abra a pele da região do pescoço fazendo um corte médio com uma tesoura. Sob um microscópio estéreo, mova as glândulas sub-mandibulares de lado e remova o músculo mastoide severo para expor a artéria carótida comum e sua bifurcação, bem como as gânglios cervicais superiores e remover o tecido ligado a ele. Disseca a bifurcação da artéria carótida direita e esquerda e o tecido ligado a ela.
Transfira cada pedaço de tecido dissecado para uma placa de Petri separada de 3,5 centímetros contendo PBS frio. Localize o gânglio cervical superior ligado à bifurcação carótida. Limpe os gânglios cervicais superiores removendo a artéria e o tecido preso.
Para dissecar o gânglio estelar, faça um corte médio no abdômen, seguido pela abertura do diafragma e da parede torácica ventral. Remova os pulmões, seguidos pelo coração, para expor o tórax dorsal. Ao nível da primeira costela, localize o gânglios aterolateral à esquerda e à direita para o musculus colli longus.
Dissecar ambos gânglios estelares com fórceps removendo o tecido circundante. Transfira-os para placas de Petri de 3,5 centímetros contendo PBS frio. Usando fórceps, transfira o gânglio cervical superior e gânglios estelares para separar tubos microcentrífugas de 1,5 mililitros e, em seguida, adicionar 500 microlitros de 0,25% solução trypsin-EDTA para cada tubo e incubar em um banho de água tremendo.
Permita que os gânglios se instalem no fundo dos tubos de microcrédito. Transfira o supernatante para um tubo de 15 mililitros contendo cinco mililitros de meio de gânglio. Aos tubos de microcrífugas, adicione 500 microliters de solução tipo 2 de colagenase e incuba em um banho de água tremendo.
Após a incubação, resuspenque o gânglio em solução de colagenase por pipetação até que os aglomerados de tecidos não sejam mais detectados. Transfira a suspensão celular para o tubo de 15 mililitros usado anteriormente contendo o meio de cultura gânglio com suspensão Trypsin-EDTA. Centrifugar a suspensão celular e descartar o supernatante celular.
Resuspende a pelota em 270 microliters de soro bovino fetal e transfira-a para um criovial de 1 mililitro. Para contar as células, misture 5 microlitadores da suspensão celular gangliônica com cinco microliters de corante azul de 0,4%. Carregue a mistura em um hemócito e conte os números totais e de células vivas sob um microscópio.
Em seguida, adicione 30 microliters de sulfóxido de dimetila a cada criovial e misture bem. Transfira os criovials para um recipiente de congelamento de células e coloque-os a menos 80 graus Celsius durante a noite. Prepare tubos de 15 mililitros com um coador de 30 micrômetros em cima.
Pré-enxágue o coador com 1 mililitro de meio de gânglio. Retire os criovials do nitrogênio líquido e descongele-os imediatamente em um banho de água a 37 graus Celsius até que uma pequena pelota de gelo seja deixada no criovial. Adicione 1 mililitro do meio gânglio em cada criovial enquanto agita cuidadosamente o frasco para recuperar as células gangliônicas.
Carregue a suspensão celular gangliônica no coador e enxágue com 4 a 5 mililitros de meio de gânglio. Centrifugar a suspensão celular tensa. Remova o supernatante e resuspenja as células em 50 microliters de tampão de lavagem celular.
Transfira a suspensão celular para um tubo microcentrífugo de baixa ligação de 0,5 mililitro. Centrifugar a suspensão celular. Uma centrífuga com um rotor de balde balançando é essencial a partir de agora.
Após a centrifugação, remova 45 microlitres do supernatante sem desalojar a pelota celular. Adicione 45 microliters de tampão de lise resfriado, suavemente misturado por pipetação, e incuba as células por 8 minutos no gelo, em seguida, adicione 50 microliters de tampão de lavagem de núcleos frios a cada tubo. Centrifugar a suspensão dos núcleos e remover 95 microlitres do supernatante sem interromper a pelota dos núcleos.
Adicione 45 microliters de tampão de lavagem de núcleos refrigerados à pelota, repita a centrifugação e remova o supernatante. À pelota do núcleo, adicione 50 microliters de ST-SB e pipeta suavemente até que os núcleos sejam completamente ressuspended, em seguida, adicione 5 microliters de fc bloqueador reagente e incubar por 10 minutos no gelo. Em seguida, adicione 1 microliter de anticorpo hashtag de núcleo único e incubar por 30 minutos no gelo.
Após a incubação, adicione 100 microliters de ST-SB a cada tubo. Centrifugar a suspensão e remover 145 microlitres do supernatante sem interromper a pelota dos núcleos. Repita a centrifugação e remova o sobrenatante.
Resuspenque a pelota dos núcleos em 50 microlitadores de ST-SB e misture suavemente. Pegue 5 microlitros da suspensão dos núcleos e misture-o com 5 microlitros de azul trypan de 0,4% para contar os núcleos sob um microscópio. Mais uma vez, centrifugar a suspensão dos núcleos e resuspensar a pelota dos núcleos em ST-SB para alcançar uma concentração de núcleos-alvo de 1.000 a 3.000 núcleos por microliter.
Puxe as amostras para alcançar o número desejado de células. A análise de controle de qualidade para a preparação da biblioteca mostrou cDNAs derivados de hashtag oligo menores que 180 pares de base. Um pico amplo de 300 a 1.000 pares de base representava uma biblioteca de expressão genética de alta qualidade, enquanto um pico específico de 194 pares de base mostrou a biblioteca de oligo hashtag.
A análise de sequenciamento de RNA de núcleo único revelou que 12 clusters visualizados por anticorpos UMAP e hashtag foram distribuídos entre todos os clusters. A rotulagem específica por hashtag oligos foi confirmada pela expressão de Xist. Hashtags 1 a 4 rotuladas de fêmea, enquanto 5 a 8 amostras masculinas rotuladas.
A qualidade e resolução dos dados de sequenciamento foram verificadas por transcrições-chave como TH, DBH e SNAP25 nos clusters 5 e 7 para neurônios simpáticos, S100B em clusters 0 a 3 para células gliais de satélite, PECAM 1 no cluster 4 para células endoteliais e ACTA2 no cluster 8 para células estrômicas. Ao tentar este método, é importante lembrar a preparação adequada e equipamentos adequados, como tesouras de dissecção fina, pinças afiadas e uma centrífuga com rotor de balde balançando são essenciais. A abordagem stepwise para o sequenciamento de RNA de núcleo único da gânglio cardíaco extrínseca simpática tem o potencial de ampla aplicação na caracterização do gânglio inervando outros órgãos e tecidos relacionados na saúde e na doença.
