Demonstramos inúmeros métodos para todo o controle óptico e observação da atividade celular desencadeada em cardiomiócitos derivados de iPSC para triagem de drogas de alto rendimento e teste de toxicidade. Permitir a quantificação multiparamétrica dos padrões fenotípicos no tempo e no espaço, permitir a observação do efeito das drogas ao longo de horas ou dias. Este método pode ser aplicado a diferentes tipos de células, tais como, neuros, ou células beta, para triagem funcional e teste de toxicidade.
Demonstrando o procedimento estará Wan-Chi Su, um engenheiro de bioimagem do meu laboratório. Prepare a placa de vários poços antes que os cardiomiócitos iPSC sejam removidos do armazenamento a frio para descongelamento. Revestir cada poço da microplaca de 96 poços com 100 microlitros de solução de gelatina a 0,02% com 50 microgramas por mililitro de fibronectina para cobrir todas as superfícies completamente.
Transfira os cardiomiócitos iPSC do tanque de armazenamento de nitrogênio líquido para um banho de água de 37 graus Celsius. Leve o frasco para injetáveis a um armário de biossegurança de classe dois e transfira suavemente o conteúdo para um novo tubo cónico de 15 mililitros contendo nove mililitros de meio à temperatura ambiente. Centrifugar as células a 200 vezes G durante três minutos à temperatura ambiente.
Rejeitar o sobrenadante por pipeta e ressuspender suavemente as células num mililitro de meio com inibidor de ROCK micromolar 10 Y27632. As células de placa codificaram 96 placas de poço na densidade de 100.000 a 150.000 células por centímetro quadrado, de acordo com as instruções do fabricante. Após 24 horas, certifique-se de que as células ligadas à superfície da placa estão em contato com outras células.
Depois de revestir as células por 72 horas, descongele os kits virais GECIs no gelo. Prepare uma solução de estoque de kit viral de dupla resistência com o meio de manutenção. Prepare as células para a infecção, ajustando o volume médio para 100 microlitros por poço.
Adicione 100 microlitros da solução viral pré-misturada aos poços e incube por oito a 16 horas a 37 graus Celsius. Após a incubação, substitua por 200 microlitros de meio pré-aquecido. Visualize a expressão dos GECIs 24 horas após a transdução usando um sistema de imagem.
Mantenha as células na incubadora umidificada antes que os ensaios funcionais sejam realizados. Ligue todos os dispositivos do sistema de imagem de alto conteúdo. Verifique se a temperatura da câmara atinge 37 graus Celsius com suplementação de dióxido de carbono a 5%.
Abra o software de imagem e escolha a configuração da placa para uma placa de 96 poços. Coloque uma placa de 96 poços sem tampa na câmara e carregue o anel de vedação de células vivas no topo. Escolha a lente objetiva de imersão em água de 20X, 60X e 20X, de acordo com a resolução espacial necessária.
Ajuste o foco para tirar imagens claras antes da aquisição experimental. Selecione três a cinco regiões aleatoriamente por poço para o registro da atividade do cálcio. Escolha filtros apropriados para diferentes indicadores.
Defina a potência do diodo emissor de luz apropriada para cada canal de imagem usado. Defina o tempo de exposição da câmera para um máximo de 40 milissegundos ou 25 hertz, e uma duração de gravação de 30 segundos para aquisição de fluxo para observar transientes de cálcio, relatados pelas sondas MNG-GECO e K-GECO expressas em cardiomiócitos. Aumente a potência do LED se a relação sinal/ruído for inferior a dois a taxas de quadros mais altas.
Para estimulação optogenética, otimize o poder e a frequência da luz azul em um hertz e inicie a aquisição. Ressuspeite a Dofetilida E4031 e o Verapamil em DMSO e dilua-os com o tampão de Tyrode. Organize bem os compostos para o alvo correspondente.
Adicione 100 microlitros do composto de dupla resistência através do sistema auto-microfluídico nos poços e inicie a aquisição após o período de incubação desejado. Isole a área do sinal do plano de fundo detectando automaticamente o recurso de pulsos, ao longo do tempo de resolução, com o software. Use o software de análise de pico de cálcio para analisar a frequência de batimento, o sinal de pico, a duração transitória de cálcio 50% de duração transitória de cálcio 90% de tempo de aumento e o tempo de decaimento.
A observação de oscilação espontânea de cálcio no NMG-GECO expressa por cardiomiócitos derivados de iPSC com ou sem tratamentos medicamentosos é demonstrada no vídeo. Traços cinéticos obtidos usando MNG-GECO mostraram que pequenos inibidores de canais iônicos moleculares Verapamil, Dofetilida e E4031 afetaram os transientes de cálcio conforme o esperado. Para avaliar a resposta à dose de E4031 sob condições padronizadas e cadenciadas, a canalrodepsina-2 e a K-GECO expressando CMs iPSC foram controlados opticamente usando pulsos de luz de um hertz e 470 nanômetros, e observados usando o sinal vermelho K-GECO.
Reduções progressivas da amplitude de pico e aumento no tempo de decaimento dos transientes de cálcio ocorrem com o aumento das concentrações de E4031. Um efeito dose-dependente do E4031 foi mais aparente para as reduções na amplitude de pico. Transientes claros de cálcio permanecem visíveis um mês após a transdução viral, ou sem a luz adicional usada para estimulação óptica.
O gráfico mostra uma droga que parece aumentar a taxa de batimento, regularizar o intervalo de contração e aumentar a amplitude transitória de cálcio, no modo CM iPSC da NCVE. A variabilidade da frequência de batimentos e o impacto subsequente na duração transitória do cálcio também mudam à medida que os CMiPSC são mantidos em cultura. Vários GECIs, incluindo ER LAR-GECO, MTG-SÉPIA e NIR-GECO, foram desenvolvidos para expressão isolada ou em combinação em modelos celulares para medição da atividade de cálcio em tempo real que surge no retículo endoplasmático, retículo sarcoplasmático, mitocôndrias e citosol, respectivamente.
Os GECIs podem ser combinados no modelo iPSC CM para estudar diferentes reservas intracelulares de cálcio. Os cardiomiócitos expressivos de K-GECO mostraram comportamento de batimento consistente ao longo do tempo. No entanto, a carga do Fluo-4 impactou tanto a frequência de batimento quanto a CTD neste modelo, sugerindo que o próprio Fluo-4 pode influenciar os resultados de tais experimentos.
Oferecemos uma maneira simples de estudar perfis fenotípicos a partir de células de controle e derivadas do paciente, enquanto o iPSC intermediário pode lançar luz sobre a descoberta de medicamentos em várias doenças.
