Este protocolo é importante porque é simples de executar e ao alcance de qualquer laboratório. Este protocolo permite o isolamento de peptídeos tipo I ou MHC tipo I ou tipo II de amostras humanas ou de camundongos. Este método pode abordar questões científicas relacionadas a todas as áreas de pesquisa envolvendo o sistema imunológico, seja em câncer, virologia ou doenças autoimunes.
Este protocolo foi construído para ser acessível a qualquer pessoa que trabalhe em um laboratório de pesquisa. Basta seguir os passos. Comece a ativar as contas de brometo de cianogênio sepharose pesando 80 miligramas por amostra e transferindo-as para um tubo cônico de 15 mililitros.
Adicione cinco mililitros de ácido clorídrico de um mililitro. Pipeta para cima e para baixo cinco vezes para facilitar a ressuspensão das contas secas, e, em seguida, encher o tubo cônico com um adicional de 8,5 mililitros de ácido clorídrico de um mililitro. Gire as contas a 20 RPM por 30 minutos à temperatura ambiente usando um dispositivo rotador.
Centrifugar as contas a 200x G por dois minutos em temperatura ambiente e remover o sobrenatante por aspiração. Adicione 500 microliters de tampão de acoplamento à paleta de contas, em seguida, transfira a suspensão da conta para um novo tubo de centrífuga de dois mililitros e reserve-o. Para acoplar os anticorpos a essas contas, adicione dois miligramas do anticorpo selecionado em um novo tubo de microcentrífuga de dois mililitros e compor o volume a um mililitro com uma solução tampão de acoplamento para obter uma concentração final de dois miligramas por mililitro.
Transfira a solução de contas previamente preparada e adicione-a à solução de anticorpos. Em seguida, gire o tubo de microcentrifuuagem a 20 RPM por 120 minutos usando um dispositivo rotador, centrifugar as contas e, em seguida, remova o supernatante como descrito anteriormente. Agora comece a bloquear e lavar as contas adicionando primeiro um mililitro de 0,2-molar glycina ao tubo de microcentrífuga contendo as contas acoplado a anticorpos, e girando a 20 RPM por 60 minutos à temperatura ambiente usando um dispositivo rotador.
Depois de centrifugar e remover o supernasce, lave as contas com um PBS mililitro, remova o sobrenatante por centrifugação e armazene as contas em um mililitro de PBS a quatro graus Celsius até o uso. Para isolar os peptídeos classe I ou II do MHC, descongele uma paleta congelada de 100 milhões de células aquecendo o fundo do tubo com uma palma. Adicione 500 microliters de PBS à paleta e pipeta para cima e para baixo até que a suspensão seja homogênea.
Transfira a suspensão em um novo tubo de microcentrífuga de dois mililitros e adicione um volume igual de tampão de lise celular. Gire a 10 RPM por 60 minutos a quatro graus Celsius usando um dispositivo rotador. Centrifugar a célula lysate a 18.000x G por 20 minutos a quatro graus Celsius com freio completo, e transfira o supernatante em um novo tubo de microcentrifutura de dois mililitros.
Recupere as contas acoplados a anticorpos por centrifugação e remoção do supernatante. Em seguida, transfira o supernanato de células para as contas acopladas a anticorpos, e incubar a 10 RPM por 14 a 18 horas durante a noite a quatro graus Celsius usando um dispositivo rotador. No segundo dia, remova a tampa inferior da coluna de polipropileno, coloque a coluna no rack da coluna de polipropileno e instale um recipiente vazio por baixo para coletar o fluxo.
Agora enxágue a coluna de polipropileno com 10 mililitros de tampão A e deixe-a drenar pela gravidade. Se a velocidade de fluxo da elução líquida for muito lenta, corte ainda mais a ponta inferior da coluna de polipropileno. Meça e colete a mistura de contas/lisesato e transfira-a para a coluna de polipropileno.
Deixe a mistura líquida elute pela gravidade. Opcionalmente, colete e congele 20 microliters de alíquota para a mancha ocidental. Agora lave as contas retidas na coluna de polipropileno adicionando 10 mililitros de tampão A e deixando-a eluto pela gravidade.
Remova a coluna de polipropileno do rack e coloque-a na parte superior de um novo tubo de microcentrífuga de dois mililitros, segurando a coluna e o tubo junto com a mão. Adicione 300 microliters de 1%TFA à coluna de polipropileno e misture as contas com tubulação para cima e para baixo cinco vezes. Em seguida, transfira o eluato em um novo tubo de microcentrífuga de dois mililitros.
Para desalar e eludir os peptídeos MHC, adicione 200 microliters de metanol em cima da coluna C-18 e centrífuga a 1,546x G por três minutos para descartar o fluxo. Adicione 200 microliters de 80% de acetonitrila em 0,1% TFA em cima da coluna C-18 e novamente centrífuga para descartar o fluxo-through. Em seguida, adicione 200 microliters de 0,1% TFA, descartando o fluxo por centrifugação.
Finalmente, carregue 200 microliters dos complexos de peptídeos MHC em cima da coluna C-18, descarte o fluxo através de centrifugação e repita até que o volume completo seja carregado. Em seguida, adicione 200 microliters de 0,1% TFA, centrífuga para descartar o fluxo- through, transfira a coluna C-18 para um novo tubo de microcentrífuga de dois mililitros e peptídeos elute MHC adicionando 150 microlitres de 28% acetonitrilo em 0,1% TFA. Após a centrifugação, colete o fluxo em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Repita o processo de eluição duas vezes para um volume total de 450 microliters e congele a menos 20 graus Celsius até ser analisado por LC-MS-MS. Use estes peptídeos purificados para identificação de peptídeos classe I e II mhc em um espectrômetro de massa. A eficiência vinculante das contas foi ilustrada por uma diminuição significativa na intensidade de coloração de sinal de correntes leves e pesadas quando as contas estão covalentemente ligadas às contas CNBr, em comparação com o anticorpo antes do acoplamento.
O isolamento dos complexos de peptídeos MHC após a eluição ácida foi confirmado pelo forte sinal de detecção dos complexos de peptídeos MHC usando anticorpos anti-HAL-ABC de cadeia pesada. Também foi estimada a reprodutibilidade intra e inter-individual dos resultados utilizando o protocolo atual. O coeficiente médio de variação para o número de peptídeos detectados em três diferentes réplicas biológicas foi pequeno, que variou de 1,9 a 11%No entanto, a identidade dos peptídeos variou consideravelmente, e a proporção de peptídeos reproduzidos em três réplicas biológicas variou de 39% a 63%.
Para os peptídeos classe I e classe II do mouse, os fichários fortes ou fracos predicados foram 89 e 87%, respectivamente. Para os peptídeos hla humanos classe I e classe II, as pastas fortes ou fracas predicadas foram 97 e 70%, respectivamente. Os motivos de ligação peptíde do mouse e humano para peptídeos classe I e classe II também foram gerados.
Antes da otimização deste protocolo, o isolamento dos peptídeos murine MHC classe I e II era bastante mais difícil. Este protocolo otimizado facilitará o isolamento dos peptídeos murine MHC classe I e II de modelos de mouse in vivo, por exemplo, usados rotineiramente para a validação de muitos estudos diversos e relacionados a doenças.
