A área é considerada de interesse em culturas 3D de células-tronco pluripotentes humanas devido à melhoria da pluripotência e potencial de diferenciação que essa cultura formou. Descrevemos nossa estratégia de encapsulamento que leva à formação reprodutível de células-tronco pluripotentes humanas esferoides. Uma vez encapsulados, esses esferoides de células-tronco são favoráveis ao cultivo, seja em placas multi-poços ou bioreatores mexidos.
Nossa estratégia de encapsulamento é otimizar a sobrevivência da peste e a alta eficiência da formação de esferoides. Os esferoides encapsulados são protegidos contra tesouras ou energia mecânica associada à agitação ou balança. O desenvolvimento de células-tronco derivadas da terapia celular depende, em parte, da capacidade de gerar o produto celular desejado de forma escalável, eficiente e econômica.
A tecnologia de encapsulamento descrita aqui representa um passo nessa direção. A tecnologia de encapsulamento descrita aqui provavelmente será aplicável ao cultivo 3D de vários tipos de células de outras células para outras células-tronco pluripotentes. Comece preparando 30 mililitros de duas vezes a solução de estoque núcleo misturando 4,8 gramas de 35 kilodalton PEG, 10,2 mililitros de mídia gradiente de densidade e 19,8 mililitros de mídia DMEM/F-12.
Em seguida, filtre esta solução principal usando um filtro de seringa de 0,22 micrômetros. Em seguida, prepare 50 mililitros de óleo mineral com 3% de surfactante, misturando 48,5 mililitros de óleo mineral e 1,5 mililitros de surfactante. Em seguida, esterilize a solução passando-a através de um filtro de seringa de 0,22 micrômetros.
Em seguida, prepare 1 molar DTT, 1 MOLAR TEA e 1% de soluções PF127, conforme descrito no manuscrito do texto. Em seguida, prepare uma emulsão de ligação cruzada misturando 4,5 mililitros de óleo mineral com 3% de surfactante e 300 microliters de 1 molar DTT. Depois de vórtice da solução por dois minutos, sonicize por 45 a 60 minutos em um banho ultrassônico a 20 graus Celsius e carregue-a em uma seringa de 5 mililitros com uma agulha calibre 27.
Em seguida, prepare a solução de óleo de proteção carregando o óleo mineral com 0,5% de surfactante em uma seringa de 5 mililitros com uma agulha calibre 27. Para preparar a solução shell, adicione 32 miligramas de peg4 maleimídeos em 400 microliters de DPBS. Em seguida, adicione 6 microliters de 1 CHÁ molar.
Vortex a solução por 2 minutos e centrifuá-la através de um filtro de giro. Mantenha a solução no escuro no roqueiro por 30 minutos antes de carregar em uma seringa de 1 mililitro com uma agulha calibre 27. Finalmente, prepare a solução final do núcleo, suspendendo 20 milhões de hPSCs em 200 microliters de mídia e misture com 30 microliters de 1% PF127 e 200 microliters de solução núcleo 2X.
Insira uma pequena barra de agitador em uma seringa de 1 mililitro. Em seguida, carregue a célula contendo solução central na seringa com uma agulha de calibre 27. Comece colocando o dispositivo de gotícula PDMS ligado, 4 peças de 20 centímetros de comprimento e 1 peça de microtubos de entrada de 5 centímetros de comprimento, 1 pedaço de tubo de saída de 10 centímetros e 6 peças de tubos de 0,5 centímetros de montagem sob a fonte de luz germicidal por 30 minutos para esterilização.
Agora, coloque as 4 peças de microtubos de entrada de 20 centímetros de comprimento na concha, óleo, emulsão transversal e entradas de dispositivos de dissociação usando fórceps. Em seguida, insira a extremidade oposta dos tubos na agulha da seringa com a solução correspondente. Enquanto isso, conecte a entrada central dos dispositivos microfluidos e a saída dos dispositivos de dissociação com um microtubo de 5 centímetros.
Insira 1 tubo de saída na porta de saída fluida e coloque a extremidade oposta em um reservatório de coleta. Em seguida, coloque o dispositivo em um estágio de microscópio e conecte a tubulação para evitar qualquer movimento. Alinhe e concentre o microscópio no bocal do dispositivo para inspeção de fluxo.
Coloque cada seringa em diferentes bombas de seringa e proteja corretamente. Programe cada bomba de acordo com os protocolos do fabricante para as taxas de fluxo mencionadas no manuscrito do texto, e inicie o fluxo em todas as bombas. Aguarde que cada fluido entre no dispositivo e encha os canais enquanto empurra o ar restante.
Quando a formação da cápsula estiver estabilizada, coloque a extremidade oposta do tubo de coleta em um novo tubo cônico contendo 5 mililitros de mídia mTeSR. Uma vez coletadas cápsulas suficientes, incuba-as por 10 minutos. As cápsulas que residem na fase do óleo estarão na parte superior do tubo, que sedimenta até o fundo ao tocar suavemente o tubo.
Para recuperar as cápsulas, comece removendo o óleo do tubo de coleta. Em seguida, coloque as cápsulas em um coador de células de tamanho de poros de 100 micrômetros e lave o coador com quantidades abundantes de mídia. Inverta o filtro em cima de um poço de uma placa de cultura de 6 poços e colete as microcápsulas passando 2 mililitros de mídia através do filtro.
Incubar as cápsulas de células-tronco em um prato de cultura de 6 poços a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Mude a mídia a cada dois dias coletando as cápsulas em um filtro de filtro de coador celular, lavando-as com excesso de mídia e reinstando-as para um novo poço em placas de 6 poços com mídia de 2 mililitros. Realize o teste de viabilidade adicionando 4 microlitres dos 2 micromolares Ethidium Homodimer-1 e 1 microliter das 4 soluções micromolar Calcein-AM a 2 mililitros de DPBS estéreis.
Vórtice para garantir a mistura completa. Colete aproximadamente 100 microcápsulas em um coador de células e enxágue-as com DPBS estéreis para permitir a difusão média das cápsulas. Colete-os novamente em uma placa de cultura de 12 poços usando 1 mililitro da solução preparada contendo Ethidium Homodimer-1 e calcein AM e incubar a 37 graus Celsius por 20 minutos.
Visualize as células sob um microscópio de fluorescência. As microcápsulas ideais e subótimas fabricadas usando a geração de gotículas microfluidas mostraram diferenças na morfologia da cápsula em função do conteúdo PEG4-Maleimide na casca. Cápsulas lisas com bordas brilhantes estão associadas à integridade mecânica desejada.
A agregação de contas no centro das cápsulas indica que o núcleo era aquoso e as contas estavam livres para se mover. O anulo fluorescente indicou a presença de uma concha de hidrogel e foi usado para determinar a espessura da casca. Manchas vivas ou mortas 6 horas após encapsular células H9 mostraram que as células alcançaram mais de 95% de viabilidade rotineiramente durante as corridas de encapsulamento.
Ao comparar a taxa de crescimento e o potencial de diferenciação dos esferoides encapsulados versus não encapsulados. Foi determinado que o processo de encapsulamento não tem efeitos adversos sobre os hPSCs. Lembre-se, é importante estabelecer uma relação de fluxo ideal entre a camada central e as correntes de óleo.
Não fazer isso pode resultar em cápsulas que não serão mecanicamente fortes e podem romper durante o manuseio. Gostaríamos de salientar que esta técnica de encapsulamento era para tipos celulares que não fossem células-tronco pluripotentes humanas. Encapsulamos, principalmente hipóteses, linhas de células cancerígenas, e células-tronco mesenquimais usando uma estratégia semelhante.
Atualmente, nossa equipe está desenvolvendo a próxima geração de microcapaturas. Essas microcapaturas são bioativas e podem ser carregadas com fatores cruzados para diferenciação encapsulada de células-tronco.
