Este protocolo permite que o fibroblasto construa e organize seu próprio ambiente em condições mecânicas definidas. Estes resultam em tecidos anisotrópicos com rigidez e composições matriciais comparáveis ao ambiente natural da célula. Este método permite comparar até 48 condições em paralelo.
É flexível em relação ao tipo de célula usada e às condições de cultura. Usando apenas alguns componentes bem definidos, é reprodutível entre laboratórios. Aplicando fatores pró-fibrosos ou antifibrotic, este protocolo pode ser usado para estudar os processos e terapias subjacentes de doenças fibrosas de qualquer tipo.
Demonstrando o procedimento estará Alisa Degrave, uma estudante de doutorado do nosso laboratório, e eu. Para começar, descongele os fibroblastos cardíacos preservados por crio-preservados em um banho de água a 37 graus Celsius por aproximadamente dois minutos até que o frasco fique com apenas uma pequena quantidade de gelo. Em seguida, transfira a suspensão celular em sentido de gota usando uma pipeta sorológica de dois mililitros em um tubo de centrífuga estéril apropriado contendo 10 mililitros de meio de crescimento de fibroblasto.
Para a recuperação ideal da célula, enxágue o crio-frasco com um mililitro de FGM e transfira-o para o tubo de centrífuga. Levemente resuspenque as células e transfira para um frasco de cultura celular. Reponha a FGM a cada dois dias durante cinco dias ou até que as células tenham atingido 80% de confluência.
Depois de aspirar o meio das células cultivadas, lave as células com seis mililitros de PBS e aspira, em seguida, adicione seis mililitros do reagente de dissociação celular às células e incuba até que o descolamento celular seja visível. Neutralizar a atividade enzimática adicionando seis a 12 mililitros de FGM às células desalojadas no reagente da associação celular. Pipeta suavemente para cima e para baixo quatro a oito vezes usando uma pipeta sorológica de 10 mililitros para garantir uma suspensão unicelular e transferir as células para um tubo fresco de coleta de 50 mililitros.
Verifique o rendimento com a ajuda de um contador automático de células de acordo com as instruções do fabricante e pelota para baixo das células. Após a centrifugação, aspire o supernasce, flick o tubo para desalojar a pelota e resuspensar as células em FGM. Em seguida, coe a suspensão celular através de um filtro de célula de malha de 40 micrômetros, em seguida, usando um contador celular automatizado, avalie o número celular e a viabilidade por exclusão elétrica de corrente elétrica para garantir números celulares confiáveis antes de prosseguir com tecidos conjuntivos projetados ou preparação de ECT.
Para se preparar para a ECT, ajuste a suspensão celular para as 8,9 milhões de células por mililitro a 20 a 25 graus Celsius adicionando FGM e mantendo as células no gelo. Transfira todos os outros tubos contendo os componentes individuais da mistura de hidrogel ECT para gelo e pré-esfrie um tubo vazio de centrífuga de 50 mililitros para preparar a mistura. Comece a preparar a mistura de hidrogel ECT adicionando componentes descritos no texto ao tubo de centrífuga pré-refrigerado de 50 mililitros evitando a formação de bolhas de ar.
Em primeiro lugar, pipeta o colágeno solúvel ácido I hidrogel em uma pipeta sorológica com uma ponta larga de furo. Ajuste o teor de sal da solução de colágeno adicionando o DMEM enquanto gira suavemente o tubo para uma mistura adequada. Para neutralizar o pH, adicione 0,2 hidróxido de sódio molar enquanto gira o tubo e confirme a neutralização observando a cor vermelha do indicador vermelho fenol.
Em seguida, adicione a suspensão da célula em sentido baixo enquanto gira suavemente o tubo. Misture a suspensão gentilmente encanando para cima e para baixo apenas uma vez usando uma pipeta sorológica com uma ponta larga para evitar a formação de bolhas e minimizar o estresse da tesoura. Gire suavemente o tubo 10 vezes para misturar completamente.
Mantenha o tubo de centrífuga contendo mistura de hidrogel ECT no gelo durante todo o processo de fundição. Molhe uma ponta de pipeta de um mililitro na mistura de hidrogel ECT, depois distribua 180 microliters de mistura de hidrogel uniformemente em cada molde da placa de fundição de 48 poços evitando forças excessivas de cisalhamento que podem afetar a integridade da montagem da matriz de colágeno e garantindo que toda a placa termine em 15 a 20 minutos. Certifique-se de que um laço completo se forme dentro do molde, pois a distribuição descontínua da mistura ECT impedirá uma formação completa do anel ECT.
Evite a tubulação no poço interno e a formação de bolhas durante a pipetação para garantir uma fundição uniforme de hidrogel ECT para formação homogênea e funcional do tecido. Coloque cuidadosamente a placa de fundição de 48 poços dentro da incubadora de cultura celular para reconstituir a mistura de hidrogel ECT por 15 a 30 minutos. Após a incubação, parece gel e opaco.
Adicione 600 microliters de 37 graus Celsius quente FGM por poço ao longo da parede suavemente para evitar o descolamento de ECT a partir da parte inferior. Substitua o meio todos os dias por 500 microliters de FGM até a análise. Nos pontos de tempo desejados, use um microscópio estéreo para gravar imagens microscópicas das vistas superiores e laterais da ECT.
Use um programa de processamento de imagens para realizar uma análise de varredura de linha. Defina uma escala e use a ferramenta de linha reta para rastrear e medir os diâmetros da ECT em um mínimo de seis posições por braço em cada plano de imagem. Imagem a placa de fundição de 48 poços sob um dispositivo de gravação com uma câmera de varredura de área integrada colocada a uma distância fixa equipada com um sensor de imagem monocromática de alta resolução e uma fonte de luz quase UV.
Realize a detecção automatizada das pontas dos polos contendo corante fluorescente para maximizar o contraste. Meça a distância entre os polos dos registros diários usando uma análise automatizada executando as imagens gravadas em software para detectar pixels brilhantes de alto contraste em um fundo escuro ou em um programa de processamento de imagens. Remova o ECT dos postes de retenção e insira um gancho de transferência e um laço ECT.
Em seguida, transfira o ECT para dois ganchos fixados no braço estacionário e o braço transdutor de um riometro mecânico dinâmico extensal equipado com um banho de órgão temperado de 37 graus Celsius cheio de PBS. Aplique tensão uniaxial a uma taxa linear constante, definindo o riometro em aproximadamente 1% da distância inicial entre os ganchos por segundo. Uma taxa de alongamento constante de 0,03 milímetros por segundo pode ser usada com dimensões típicas de ECT.
Rasgue a força do transdutor e inicie o trecho. Continue registrando até o ponto de ruptura da ECT após normalizar a força medida por área transversal e plote a curva de tensão determinando diferentes parâmetros biomecânicos. Pouco antes do tecido iniciar a micro fratura, o limite superior da região elástica corresponde ao ponto de rendimento e sua tensão é uma medida de elasticidade tecidual.
A região de plástico está entre o ponto de rendimento e o ponto de falha. O ponto de falha corresponde a uma queda repentina do estresse devido à ruptura do tecido, definindo a tensão final que é uma medida de extensibilidade tecidual. O terceiro ponto de medição corresponde à força máxima definida pelo maior estresse que o tecido pode suportar sem quebrar durante o trecho.
A resiliência e resistência dada pela área sob a curva corresponde à energia absorvida pelo tecido até o ponto de rendimento e ponto de falha, respectivamente. Para cada curva obtida, a inclinação da parte linear da região elástica corresponde ao módulo de Young, também conhecido como módulo elástico. É uma propriedade mecânica que mede a rigidez do tecido.
Usando este protocolo, a compactação e contração da ECT sob condições de controle e na presença de FCS se seguiu algumas horas após o casting e notavelmente aumentou até o quinto dia. Quando a ECT foi tratada com o inibidor de polimerização de actina Latrunculin A, a compactação da ECT foi reduzida conforme indicado pela área transversal significativamente maior em comparação com o controle. A contração dos tecidos foi avaliada durante os cinco dias de cultura.
Na ausência de Latrunculin A, a contração aumentou gradualmente até o quinto dia, atingindo cerca de 40% de contração. No entanto, a presença de Latrunculin A afetou a contração tecidual, resultando em apenas uma contração máxima de cerca de 20%. A inibição da polimerização de actina levou a uma redução significativa de cerca de 50% na rigidez tecidual sobre o controle.
Esses resultados demonstram que a integridade citoesquelética actin é essencial para a compactação, contração e endurecimento da ECT. É importante selecionar uma solução confiável e de alta qualidade de colágeno e garantir que uma suspensão unicelular com alta viabilidade seja usada para reconstituir tecidos conjuntivos projetados.
