O objetivo geral do procedimento que detalhamos aqui é dissecar o envolvimento do cílio primário durante o desenvolvimento neocortical. Os cílios primários têm sido mostrados cruciais para muitas etapas do desenvolvimento neocortical, incluindo expansão celular progenitora, determinação do destino, bem como migração neuronal e maturação. Para dissecar ainda mais o envolvimento celular durante o desenvolvimento neocortical, criamos ferramentas relevantes aproveitando modelos emergentes baseados em células 2D e 3D de desenvolvimento neocortical.
Em outras palavras, rosetas neurais e organoides de antebraína dorsal. Os modelos baseados em células iPS 3D começam com a formação do corpo embrionário. A adesão dos referidos corpos embrionários permite a geração de estruturas de rosetas neurais 2D, enquanto a cultura flutuante livre de tais EBs permite a geração de organoides forebraíndos dorsais.
O protocolo que criamos para gerar organoides cerebrais baseia-se em protocolos publicados anteriormente usando o método de engasgo, adicionando fatores de pré-padronização para gerar organoides de forebraína dorsais especificamente usando inibidores da via nídal e BMP, também conhecida como inibição dupla de SMAD. Para aproveitar a organização 3D dos organoides, criamos um método simples e rápido, permitindo a aquisição total de imunolabeling, compensação e aquisição iluminada de todo o organoide com alta resolução. E para focar na biogênese e funções do cilium primário, adaptamos a imunohistoquímica em seções flutuantes cortadas com um vibratome.
Após a imunostenção e limpeza das seções, adquirimos as imagens usando microscopia confocal de varredura ressonante. Comece com culturas celulares iPS abrigando grandes colônias regulares, exibindo menos de 10% de diferenciação e não são mais do que 80% compatíveis. Dissecar manualmente cada colônia de células iPS usando uma agulha, permitindo capturar precisamente cada colônia em direções horizontais e verticais para criar um padrão de tabuleiro de xadrez, dividindo cada colônia em aglomerados iguais.
Retire a colônia usando um raspador de células e transfira-os para uma placa de cultura de apego ultra baixo. Deixe-os flutuar durante a noite na incubadora para que possam formar corpos embrionários. No dia seguinte, vire o meio, tomando cuidado para não aspirar os corpos embrionários, e transfira-os para pratos revestidos de Laminina Poli-L-ornithine até a formação de rosetas neurais.
Isso leva aproximadamente 12 a 14 dias. Indução diária de atualização, média e verificação sob microscópio para formação de estruturas de roseta neural. A partir desta etapa, as rosetas neurais podem ser expandidas, diferenciadas e processadas para análises imunossurgirem ou desassociadas para obter culturas neurais e células progênitas isoladas.
Em primeiro lugar, comece com culturas iPS abrigando grandes colônias regulares que exibem menos de 10% de diferenciação e que foram passagens quase uma vez na monocamada. No dia zero, permita que a célula iPS forme corpos embrionários em meio EB contendo baixa concentração de fJ2 e uma alta concentração de inibidor de ROCHA necessário para a sobrevivência celular hiiPS para evitar placas de incubadora de formação EB perturbadoras por três dias sem alteração média. No terceiro dia, os EBs devem medir aproximadamente 400 micrômetros e mostrar fronteiras regulares.
Se critérios passados são ricos para a maioria dos EBs, altere o meio com o meio de indução contendo inibidores duplos de SMAD certamente para iluminar os DBs contra em melhor seis a sete, indicando concessão de tomaly neural. E eles transformam outros DBs em métricas de membrana de porão reduzidas. A partir desta etapa use sempre uma tesoura estéril para obter a abertura dos peptídeos para evitar danos aos organoides.
Primeiro transfira cerca de 15 organoides para um tubo clínico. Deixe o EB assentar e remova o meio a 50 microliters de meio de indução dois e transfira os organoides para um tubo microsensível contendo 100 microliters de matriz e homogeneizado por tubulação para cima e para baixo. Espalhe a mistura no centro de um poço de uma placa de fixação neutra.
E, finalmente, eBs espaciais para que eles não se toquem uns aos outros para evitar que eles se fundam. Deixe a matéria solidificar na incubadora por 45 minutos, adicione meio de indução dois a cada poço e incubar na incubadora. Refrescar o meio de indução dois a cada dois dias.
No dia 17, desassociar a matriz de membrana do porão manualmente, pipetando para cima e para baixo 10 vezes com five ml pipetas. Incubar a placa organoide no meio de tradução em agitação para melhorar a absorção nutricional. É importante ressaltar que use uma incubadora diferente para cultura estacionária e cultura no agitador orbital para evitar vibrações prejudiciais para o crescimento de células iPS aderentes.
Após a fixação, a permeabilização, o bloqueio e a incubação com anticorpos primários e secundários levam 10 dias, incluindo etapas de lavagem. O método de compensação que favorecemos depende do TDE, um derivado de glicol. Para uma clareira ideal, entuba o organoide na solução TDE com concentração gradualmente aumentada por 24 horas cada.
Para incorporação organoide, use sistema de moldagem principal personalizado feito a partir da seringa de um ml, que ponta é cortada usando um bisturi. Baixo ponto de fusão Agarose é recomendado, pois sua temperatura de fusão é de apenas aproximadamente 60 graus Celsius. Prepare 4% de derretimento baixo Agarose em solução 60% TDE e deixe esfriar apenas cerca de 37 graus Celsius em uma base de água pré-organóide incorporando.
Coloque na seringa 600 microliters da solução gel usando o êmbolo, em seguida, posicione a amostra e preencha a seringa com 400 microliters da solução gel. Deixe o gel polimerizar, e finalmente, a amostra é montada idealmente dentro do gel e pode ser facilmente empurrada para fora dentro da câmara iluminada para posicionar o organoide na frente do objetivo. A microscopia de fluorescência iluminada é ideal para a primeira imagem de organoide tão claro.
Reduzimos a imagem fotográfica e pesamos a resolução subcelular. Aqui, utilizamos um objetivo de 20x immerged em 80% de solução TDE adicionada na câmara de amostra para permitir ajustar com precisão ao índice de refração do nosso método de compensação. A maior ordem amostral foi projetada para acomodar uma seringa de um mililitro que pode ser inserida a partir do topo com o êmbolo que pode ser operado uma vez que a ordem amostral é montada para posicionar o organoide na frente do objetivo.
A aquisição de um organoide inteiro leva aproximadamente 5 a 10 minutos. Para coloração imuno em seções flutuantes livres, colete e fixe seus organoides em quatro pessoas durante a noite a quatro graus Celsius. Incorpore os organoides em Agarose e seção de 4% de baixa fusão usando um vibratome para obter 150 micrômetros de seis seções transferidas em solução PBS, usando um pincel para evitar danificá-los.
Após a permeabilização e bloqueio, incubar as seções flutuantes livres com anticorpos primários durante a noite a quatro graus Celsius e sob agitação. Lave as seções cuidadosamente antes da incubação com anticorpos secundários por duas horas à temperatura ambiente e sob agitação. Finalmente, para uma limpeza ideal, incubar a seção em solução TDE com concentração gradualmente aumentada por uma hora e 30 em 60% TDE e, em seguida, em 80% TDE durante a noite à temperatura ambiente.
Armazene a seção em 80% de solução TDE e TLAC a quatro graus Celsius. Monte seção flutuante livre em uma câmara celular, esforçando-se para manter a amostra em solução 80% TDE e projetada para se adaptar em um estágio motorizado de microscópios clínicos. Primeiro, coloque um deslizamento de cobertura redonda na câmara e transfira cuidadosamente a proteção clara usando um pincel.
Encha a câmara com solução 80% TDE e, em seguida, adicione dois deslizes de cobertura padrão mais um deslizamento de tampa em segundo turno e um selo de silício. Por fim, aparafusar o anel de rosca da câmara para selar perfeitamente o sistema. Nightsheet, bem como aquisições de ressonância são processadas graças a um software que permite a utilização 3D e uma análise de toda a amostra de imunossuagem.
Esse software permite que você abra rapidamente dados enormes que geramos para fazer facilmente instantâneos e animações. Ele permitiu mover a amostra em diferentes orientações e podemos gerar visualizações 2D da imagem graças a uma ferramenta de fatiador 2D em diferentes orientações, X, Y e Y, Zed, por exemplo. Além disso, esse software permite a detecção automática de cílios centristas e primários, permitindo quantificar o número em condições patológicas versus controle.
Também permite a reconstituição 3D de cílios primários para medição precisa dos locais. O protocolo que descrevemos para modelagem baseada em células 2D iPS de novo desenvolvimento cortical permite a geração de estruturas de roseta neural que contêm novos progenitores corticais e neurônios semelhantes aos vistos no neocórtex em desenvolvimento. A validação detalhada pode ser realizada por meio da análise convencional de imunostaining.
Os progenitores aplicáveis devem ser duplamente manchados conosco para sensibilidades de impacto, enquanto progenitores intermediários são revelados pela coloração TBI2 e neurônios neocorticais ósseos precoces por manchas positivas CTIP2. Tais estruturas neurais semelhantes a rosetas modelam a migração nuclear intercinética de progenitores radicais que podem ser visualizados por imunostaining com anticorpos levantados contra a vimentina fosfo que mancha núcleos mototicos e TBX2 que sustenta o fuso mitotístico. Finalmente, a ciliagênese pode ser analisada por imunossuagem com anticorpos levantados contra pericêntricos, que mancha o corpo traseiro da cília primária e são de certos meios que mancham o axioma.
Em tal estrutura de roseta, cilia primária extraída dos progenitores a apical poly Fabri-Kal e densamente acima do lúmen central de cada região ventriculite enquanto eles também estão salientes de neurônios CTIP2 positivos. A dissociação de rosetas adenoneuras permite gerar culturas neurais e células progenitoras isoladas que são altamente úteis para analisar a biogênese e a função do círio primário. Em particular, detalhamos o procedimento para testar a indução da via sônica após o tratamento com medicamentos sônicos recomendados ou agonistas de osmosina.
A RTPCR SA subsequente testa a indução de genes-alvo de medicamentos sonica, como GLI1 e PTCH1, e a análise da imunofluorescência testa a dinâmica dos principais componentes de drogas sônicas ao longo do cílio primário que são quantificados, graças a ferramentas de código aberto, ilastik e CiliaQ. Diferentes parâmetros ciliares, incluindo comprimento e orientação, são investigados, mas também a intensidade dos componentes do círio primário são mostrados aqui para GLI2 e GPR161 que, respectivamente, accumuulam ou saem do círio primário em resposta ao tratamento medicamentoso sonica recomendado. O protocolo que detalhamos para a modelagem baseada em células 3D do desenvolvimento neocortical permite a geração de organoide cerebral homogêneo com identidade de cérebro dorsal que pode ser caracterizada seja pela análise convencional de imunostaining ou por coloração feminina, como mostrado aqui, com a penetração ideal dos anticorpos levantados, novamente, N-cadherin, PAX6, e CTIP2 que mancham respectivamente cadherina neuronal, em progenitores rosa, apical na zona ventricular como região, em verde, e todos os neurônios neocorticais recém-nascidos, localizados na placa cortical como região.
Aqui está um segundo filme de todo o organoide de imunostain com anticorpos levantados novamente, CTIP2, em vermelho, possivelmente manter em rosa, e TPX2, em verde, permitindo testar várias características de progenitores neocorticais, como, migração nuclear intercinética de progenitores Fabri-Kal. Curiosamente, progenitores positivos de fosfora também são observados na zona supraventricular como região e abrigam um processo positivo único que se estende à superfície positiva, lembrando progenitores gliais radiais externos e ilustrando a alta resolução deste método. Aqui está um filme de uma seção de imunostain, flutuante livre, adquirida graças a um microscópio de ressonância-varredura mostrando cílios primários detectados com anticorpo pericentrina que manchou a parte de trás do corpo, em verde, e anticorpos ARLT3B que mancham o axioma, em rosa.
Cílios primários estendem-se de todas as células-tronco neuronais e progenitoras, em particular, na superfície epical dos progenitores epicais, mas também em neurônios neocorticais da região pré-placa. Finalmente, rosetas de neurônio 2D e células-tronco isoladas e progenitoras recapitulam vários aspectos do desenvolvimento cortical cerebral e representam ferramentas complementares e úteis para testar a biogênese ciliar e a função. O protocolo que detectamos aqui nos permitiu gerar com sucesso organoides de cérebro dorsal a partir desta distintas linhas celulares iPS que dão origem a resultados homogêneos, garantindo a robustez deste procedimento.
Os protocolos que estabelecemos para imunossuagem, limpeza e imagem de organoides inteiros ou seções flutuantes livres são simples, rápidos e econômicos. A combinação desses modelos baseados em células e a análise de imagem 3D em células iPS, geradas pela reprogramação de células de perturbação ciliar ou pelo uso da tecnologia CRISPR 9 para editar especificamente genes ciliares, devem permitir progressos significativos na compreensão da contribuição do círio primário durante o desenvolvimento normal e patológico do córtex cerebral.
