Este protocolo é significativo porque fornece o procedimento completo para a criação de gotículas do filme lipídeca para solução lipídica para microbolhas e, em seguida, para gotículas. A principal vantagem dessa técnica é a simplicidade para condensar microbolhas em gotículas. Apenas resfriando e girando, gotículas podem ser feitas sem a necessidade de pressurização.
Uma demonstração visual é fundamental porque um simples teste para ver se os microbolhas foram condensados com sucesso é verificando visualmente a mudança na translucência. Demonstrando o procedimento estará Kimoon Yoo, um estudante de mestrado no laboratório Gang Zheng. Usando um decapper, remova o selo de alumínio no frasco de soro e transfira um mililitro da solução lipídica para um frasco de amostra de vidro borossilicato de 1,85 mililitro com uma tampa de parafuso fenol, deixando a solução lipídica fluir pela parede interna sem criar bolhas.
Com o frasco de amostra de 1,85 mililitro prepare-se para fluir em gás decafluorobutano no espaço de cabeça do frasco de amostra usando o trocador de gás. Certifique-se de que todas as válvulas do trocador de gás estejam devidamente fechadas e que a bomba esteja desligada. Abra a válvula de coletor e desemplha cuidadosamente a agulha correspondente do coletor.
Abra a válvula de pressão A e a válvula de pressão B e gire a válvula do cilindro de gás aproximadamente 1/16 a 1/8 no sentido anti-horário para abri-la parcialmente. Abra a válvula de alça T e desnaça o frasco de amostra com a solução lipídica. Coloque a agulha do coletor acima da interface de ar líquido do frasco, gire lentamente a válvula reguladora de ar no sentido horário até que a agulha do medidor de regulagem de ar se mova ligeiramente de sua posição de descanso e deixe o gás perfluorocarbono fluir suavemente para o espaço de cabeça do frasco por 30 segundos, tomando o cuidado de não criar bolhas.
Ajuste a válvula reguladora de ar, se necessário. Após 30 segundos, cuidadosamente e rapidamente manteve o frasco de amostra sem mover muito o frasco. Tanto a válvula do cilindro de gás, a válvula t, a válvula reguladora de ar, a válvula de pressão A, a válvula de pressão B e a válvula de coletor.
Embaa por pouco a agulha, em seguida, rotulou o frasco de amostra e selar o pescoço com filme de cera indo no sentido horário. Armazene o frasco de amostra no escuro e a quatro graus Celsius por pelo menos 10 minutos ou até 24 horas. Coloque cerca de 100 gramas de gelo seco em um recipiente isolado no lugar de gelo regular em outro recipiente isolado.
Recupere um frasco de soro de decafluorobutano previamente preparado para agulhas de calibre 1,5 polegadas de 20, uma seringa de plástico de um mililitro, um recipiente de 200 mililitros, pinças metálicas e um termômetro. Coloque o frasco de amostra com a solução lipídica no agitador mecânico e agitar por 45 segundos. Deve haver uma mudança de cor e translucência.
Após a agitação mecânica, mantenha o frasco de amostra do lado direito para cima protegido da luz e inicie uma contagem regressiva de 15 minutos para esfriar o frasco e o tamanho selecione os microcompletos. Quando a contagem regressiva chegar a 10 minutos, encha um recipiente com cerca de 200 mililitros de isopropanol e esfrie-o a menos 20 graus Celsius com gelo seco usando pinças metálicas. Depois que os microcompletos tiverem sido selecionados por 15 minutos, procure o tamanho da partição selecionada dentro do frasco de amostra.
Mantendo o frasco de amostra para cima, cuidadosamente descapou o frasco de amostra e retire cerca de 0,7 mililitros da partição inferior com uma agulha de calibre 1,5 polegadas de 20 polegadas presa a uma seringa de plástico de um mililitro. Certifique-se de que nenhuma parte superior seja retirada e não aperte a seringa para remover os bolsões de ar. Visando o círculo central na rolha de borracha, insira uma agulha diferente de 20 bitolas em um frasco de soro de decafluorobutano, mantendo a agulha perto do topo do frasco de soro para ventilar e, em seguida, inserir a agulha com o tamanho das microbolhas selecionadas.
Transfira lentamente o tamanho dos microbolhas selecionados. Deixe o líquido deslizar suavemente pela parede interna do frasco de soro de decafluorobutano. Uma vez que toda a solução de microbolhas selecionada tenha sido transferida, remova a agulha com a seringa, mas mantenha a agulha de ventilação para aliviar a pressão negativa.
Adicione pequenas quantidades de gelo seco ou isopropanol de temperatura ambiente ao banho de isopropanol para garantir que a temperatura do banho esteja entre menos 15 a menos 17 graus Celsius. Com a agulha de ventilação de 20 medidores inserida perto da parte superior do frasco de soro, coloque o frasco de soro e o banho de isopropanol, mantendo o nível de microbolhas abaixo do nível do isopropanol, mas o pescoço de frasco acima dele e intermitentemente girou o frasco de soro por dois minutos para condensar as microbolhas. Não gire o frasco de soro continuamente no isopropanol e não deixe a solução congelar.
Gire por cerca de cinco segundos e levante o frasco de soro para fora do isopropanol. Verifique se há nucleação de gelo e retome o giro em isopropanol. Se houver formação de gelo, gire o frasco de soro no ar até que se dissipe.
Após a condensação de dois minutos, remova o frasco de soro do banho isopropanol e remova a agulha de ventilação. Os microcompletos devem ter condensado em gotículas, conforme indicado pela mudança na translucência. Limpe o frasco de soro, rotule-o e coloque-o em gelo normal em um recipiente isolado escuro até estar pronto para uso.
Gotículas não abertas com uma vedação de alumínio intacta devem ser estáveis por até seis horas, desde que o gelo derretido seja substituído conforme necessário. Quando estiver pronto para usar, remova o selo de alumínio com o descafeinado. Depois de usar este protocolo, microbolhas pré-condensadas, tamanho selecionado e gotículas pós-condensadas foram dimensionadas em um contador Coulter com uma abertura de 10 mícrons.
Os dados de dimensionamento para a formulação de 30% piro-lipídas são mostrados. As estatísticas baseadas nos dados de dimensionamento são mostradas aqui. Utilizando uma proporção de diâmetros médios pré e pós-condensados, os resultados mostraram que, à medida que o teor piro-lipídial aumentava, a concentração diminuía e o diâmetro médio aumentava.
As medidas de absorventes representativas da amostra de gotículas piro-lipídicas de 30%. Isso mostrou que os conjuntos intactos têm diferentes propriedades ópticas refletidas por diferentes picos em comparação com os componentes lipídudos individuais desmontados. As medições representativas de floresnce da microbolhas pré-condensadas, amostra de gotícula pós-condensada com 30% piro-lipídio são mostradas aqui, demonstrando diferentes picos de fluorescência para amostras intactas na forma interrompida.
Imagens representativas de ultrassom das gotículas 30% piro-lipídicas são mostradas em diferentes pressões. Em baixas pressões, apenas o sinal de fundo das bolhas de ar presas da síntese de ágar foi observado. Com um poder ligeiramente maior, foram gerados alguns microbolhas, o que é demonstrado pelo aparecimento de manchas brilhantes.
Mais microbolhas foram geradas à medida que a pressão aumentava. É importante lembrar que a temperatura de condensação aqui é otimizada para esta formulação específica de concha de gotícula. Diferentes formulações de conchas podem exigir uma temperatura diferente.
