Este protocolo descreve os procedimentos e as etapas críticas das preparações de pseudovírus H5 de alta patogenicidade para influenza aviária e ensaios de neutralização de pseudovírus. Além disso, discute a limitação da solução de problemas e as modificações desses ensaios. Patógenos de alta patogenicidade devem ser realizados no laboratório de biossegurança de nível três, enquanto pseudovírus podem ser manuseados com segurança em laboratório de biossegurança de nível dois.
Para começar, faça uma suspensão de célula única de células HEK293 FT em um meio DMEM completo. Adicionar 10 mililitros da suspensão de célula única a um balão T75, seguido de incubação a 37 graus Celsius. Duas horas antes da transfecção, substitua o meio antigo por 10 mililitros de meio fresco completo por cloroquina.
Misture os reagentes e o DNA plasmidial conforme descrito no manuscrito e transfira essa mistura para o meio acima das células e rocha suavemente. Após a incubação, substitua o meio por 15 mililitros de meio DMEM completo fresco. Após 65 horas, colher o sobrenadante por centrifugação.
Colete o sobrenadante e alíquota. Para detectar a expressão da proteína hemaglutinina, adicione 50 microlitros de PBS nas colunas dois a 12 de uma placa de fundo redondo de 96 poços. Adicione 100 microlitros de pseudo vírus nos poços da coluna um.
Em seguida, transfira 50 microlitros de pseudovírus da coluna um para os poços da coluna dois. Efectuar esta diluição dupla até à coluna 11, seguida de uma mistura suave. Em seguida, descarte os 50 microlitros extras da coluna 11.
Adicione 50 microlitros de 0,5% de eritrócitos em cada poço seguido de uma mistura suave. Após 30 a 60 minutos de incubação à temperatura ambiente, observar e registrar os títulos de hemaglutinina do pseudovírus. Para titulação de pseudovírus, faça uma suspensão de célula única de cinco vezes 10 a quarta células por mililitro de células MDCK em um meio DMEM completo.
Adicione 1, 250, 2, 500, 5, 000, 10, 000, 20, 000 e 40.000 células a diferentes poços de uma placa de fundo plano de 96 poços. Após a incubação, descongelar e vórtice o pseudovírus. Adicione seis HAU de pseudovírus a cada poço de uma placa de fundo redondo de 96 poços e reabasteça cada poço com DMEM completo até 120 microlitros.
Transfira 100 microlitros da mistura para as células da placa de 96 poços. Incubar a placa de cultura por 48, 60 e 72 horas para infecção viral e realizar um ensaio de luciferase. Para realizar o ensaio de luciferase, lave as células removendo o meio cuidadosamente e enxaguando-o com 200 microlitros de PBS.
Remova o máximo possível do PBS e, em seguida, adicione 50 mililitros do tampão de lise a cada poço. No dia seguinte, equilibre as placas à temperatura ambiente por duas horas, agite as placas de cultura várias vezes e transfira todos os lisados celulares para placas opacas de 96 poços. Adicione 50 microlitros do substrato a cada prato e misture bem.
Registre os títulos de luciferase do pseudovírus usando o luminômetro. Adicione 100 microlitros da suspensão de célula única de células MDCK a cada poço de uma placa de fundo plano de 96 poços e incube-a por 20 horas a 37 graus Celsius. Após a incubação, descongelar e vortexar o pseudovírus e os soros armazenados a menos 80 graus Celsius.
Diluir os soros 20 vezes em meio completo. Adicione 100 microlitros de meio DMEM às colunas três a 10. Adicionar 200 microlitros dos soros diluídos nos orifícios da segunda coluna e realizar a diluição em série.
Em seguida, adicione 100 microlitros de meio DMEM à 11ª coluna como controle negativo. Adicione 100 microlitros de pseudovírus a cada poço e misture. Transfira 100 microlitros da mistura da placa de fundo redondo de 96 poços para o poço correspondente da placa de cultura celular de 96 poços.
Após 60 horas de incubação a 37 graus Celsius, realizar o ensaio de luciferase. O ensaio de hemaglutinina mostrou que 643 unidades de AH por mililitro de pseudovírus influenza estão presentes nos estoques de pseudovírus influenza. As proporções de AH e Gag P24 estavam dentro da normalidade.
O ensaio de western blot mostrou a presença de quatro tipos de proteínas, incluindo HA0, HA1, HA2 e NA, indicando a similaridade dos pseudovírus influenza com os vírus selvagens. Os resultados da titulação de pseudovírus indicam que as condições adequadas para a maior atividade relativa da luciferase incluem a alimentação de 5.000 células em um poço de uma placa de 96 poços e a detecção de leituras relativas da atividade da luciferase após 60 horas da infecção pelo vírus. Os soros imunes do grupo DDV exibiram altos títulos de neutralização contra a cepa do pseudo vírus A Tailândia 1 Can 104, enquanto os soros do grupo controle não exibiram qualquer atividade de neutralização.
A atividade neutralizante dos soros imunes foi potente em comparação com os soros controle, indicando que muitos anticorpos foram direcionados para a cabeça do AH nos soros imunes. As diferenças significativas entre os soros imunes e os controles durante a avaliação da entrada viral indicam que os anticorpos são direcionados para a região do tronco HA nos soros imunes. Ao realizar este procedimento, lembre-se de manter o pH da solução de transfecção e do meio de cultura estável.
