Pequenas moléculas de sinalização visam várias proteínas efeitos para controlar a virulência bacteriana e a biologia humana. No entanto, essas proteínas efeitos são desafiadoras de identificar. Como uma ferramenta de biologia de sistemas, o DRaCALA permite uma identificação viável, rápida e altamente sensível das proteínas efeitos ou efeitos desconhecidas usando uma biblioteca OVium.
DRaCALA poderia ser usado para estudar qualquer pequena molécula de sinalização, desde que possa ser rotulada com isótopo radioativo ou corantes fluorescentes. Comece inoculando E.coli em 1,5 mililitros de LB suplementados com 25 microgramas por mililitro de clororamfenicol em cada poço de placas de poços de 96 poços profundos para uma incubação noturna a 30 graus Celsius e 160 rotações por minuto. Na manhã seguinte, trate as culturas durante a noite com 500 micromolar IPTG por seis horas a 30 graus Celsius para induzir a expressão proteica.
No final da incubação, pelota as células por centrifugação, remova o supernante, e congele as amostras a menos 80 graus Celsius. Para iniciar a lise, resuspenja as pelotas em 150 microliters de tampão de lise um por poço para uma incubação de 30 minutos a menos 80 graus Celsius antes de descongelar as células por 20 minutos a 37 graus Celsius. O lysate deve então ser armazenado a menos 80 graus Celsius antes do uso.
Para completar a lise das células com proteínas superexpressas, resuspende as amostras em 40 mililitros de tampão de lise gelada dois e sonicar as amostras a uma amplitude de 60% em dois segundos em quatro segundos de folga por oito minutos, depois limpe os lises por centrifugação. Enquanto as amostras estão sendo centrifugadas, adicione 500 microliters de resina de níquel-NTA homogeneizada a uma coluna de cromatografia de polipropileno em pé. Após 15 minutos, lave a resina assentada duas vezes com 15 mililitros de água ultrapura e uma vez com 15 mililitros de tampão de lise dois.
No final da centrifugação, carregue o supernatante de lysate limpo na coluna. Quando todo o lise tiver fluído através da coluna, lave a coluna com 30 mililitros de tampão de lavagem. Para elutar as proteínas, adicione 400 microliter volume de tampão de eluição à coluna e repita a eluição três vezes.
Mais 300 microlitrais do buffer de eluição para repetir a eluição três vezes e combinar as proteínas eludidas em um volume final de 700 microliters. Para filtragem de gel da amostra elucida, depois de lavar uma coluna de exclusão de tamanho com 25 mililitros de tampão de filtragem de gel recém-preparado, carregue todo o volume de proteína elucida na coluna usando um loop de 500 microliteres. Execute a 500 microliters por minuto e colete de duas a três frações de volume de 500 microliteres das respectivas proteínas.
Em seguida, use colunas de spin individuais para concentrar cada proteína e use o kit de ensaio de Bradford para medir as concentrações proteicas de acordo com os protocolos padrão. Para sintetizar o pentafosfato de guanosina rotulado 32, monte uma reação relseq de pequena escala em um tubo tampado de parafuso como descrito na mesa e incubar a reação em um ThermoMixer por uma hora a 37 graus Celsius e cinco minutos a 95 graus Celsius, seguido por cinco minutos no gelo. No final das incubações, gire a proteína precipitada por centrifugação e transfira o fosforo sintetizado 32 rotulado pentafosfato de guanosina contendo supernasal a um novo tubo tampado para parafuso.
Para a síntese de tetrafosfato de fósforo 32 guanosina, adicione um micromolar GppA à metade do produto de pentafosfato de guanosina rotulado 32 em um novo tubo tampado e incubar a reação por 10 minutos a 37 graus Celsius, cinco minutos a 95 graus Celsius e cinco minutos no gelo. No final da incubação, gire o precipitado por centrifugação e transfira o tetraforosfato de guanosina rotulado 32 contendo supernasal para um novo tubo. Para analisar as proteínas alvo isoladas, execute um microliter de cada amostra em uma placa de cromatografia de camada fina usando fosfato de monopotássio molar 1,5 como fase móvel.
Após a análise, coloque a placa seca em uma pasta de plástico transparente e exponha a placa a uma tela de fósforo de armazenamento por cinco minutos antes de visualizar e quantificar os dados em um imager de fósforo. Para a triagem DRaCALA das proteínas-alvo, adicione 20 microlitadores dos lises por atacado descongelados a poços individuais de uma placa de microtiter fundo V de 95 poços e adicione 2,5 unidades de Serratia marcescens endonuclease a cada poço. Depois de 15 minutos a 37 graus Celsius, coloque os lises no gelo por 20 minutos.
Em seguida, misture volumes iguais de fósforo 32 rotulados de pentafosfato de guanosina e tetrafosfato de guanosina e adicione 1X tampão de lise um à mistura para obter uma solução de pentafosfato de guanosina nanomolar. Usando uma pipeta multicanal e pontas de pipeta filtradas, misture 10 microliters da mistura de pentafosfato de guanosina com o linsato celular para uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, lave uma ferramenta de pino 96X três vezes em uma solução de 0,01% de detergente não iônico por 30 segundos, seguido por 30 segundos de secagem em uma toalha de papel por lavagem antes de colocar a ferramenta de pino na placa de amostra de 96 poços.
Após 30 segundos, levante a ferramenta do pino para cima e coloque-a em linha reta em uma membrana de nitrocelulose por 30 segundos. Após cinco minutos de secagem, coloque a membrana de nitrocelulose em uma pasta de plástico transparente para armazenamento de exposição da tela de fósforo e visualização por imagem fosfora, conforme demonstrado. Para quantificar e identificar potenciais proteínas-alvo, no software de análise associado ao imager fosforo, abra o arquivo em gel das placas visualizadas.
Para definir os pontos a serem analisados, use a função de análise de matriz para configurar uma grade de 12 colunas por oito linhas. Para circunscrever a borda externa das manchas de orifício, defina grandes círculos, exporte o volume mais fundo e área dos círculos grandes definidos para uma planilha. Para circunscrever os pequenos pontos internos, dimensione os círculos definidos, exporte o volume mais fundo e área dos pequenos círculos definidos e salve todos os dados na planilha.
Os círculos de posição se sobrepõem aos pontos conforme necessário, redimensionando os pontos ligeiramente maiores do que os reais. Use a equação para calcular as frações de vinculação na planilha e plotar os dados. Em seguida, identifique as proteínas de ligação potenciais nos poços que apresentam altas frações de ligação em comparação com a maioria dos outros poços.
Nesta análise representativa, uma placa com sinais de ligação de fundo relativamente baixos na maioria dos poços pode ser observada. O sinal de ligação positivo no poço H3 exibiu uma fração de ligação muito maior do que a observada para os outros poços devido à superexpressão da proteína de ligação de pentafosfato guanosina Hpt. Nas placas representativas, vários poços apresentaram sinais de ligação de fundo relativamente mais elevados, como indicado pelos pontos internos relativamente fortes observados em muitos poços, bem como as frações de ligação consistentemente altas observadas após a quantificação.
Notavelmente, alguns alvos também deram frações de vinculação variável, como os falsos positivos. Para esclarecer melhor, os pesquisadores usaram proteínas purificadas para testar a ligação novamente. Uma vez identificadas as proteínas-alvo, pode-se purificá-las à homogeneidade e confirmar a força e a especificidade da interação usando dRaCALA, calorimetria de titulação isotemal, ou outros métodos.
Identificar as proteínas-alvo de pequenas moléculas de sinalização abre caminho para uma compreensão aprofundada dos papéis emergentes da virulência bacteriana à biologia humana.
