Name: applications of immobilization of drosophila tissues with fibrin clots for live imaging
Uploaded: 2020-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging at JoVE.com

O trabalho no laboratório Januschke é apoiado pelas bolsas de confiança Wellcome 100031/Z/12/A e 1000032/Z/12/A. A instalação de imagem tecidual é apoiada pela concessão WT101468 da Wellcome.

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G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling.">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. 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ImageJ macros [software] Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories">https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories</a> (2020)</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Imagens ao vivo de cérebros larvais de montagem d. melanogaster fornecem a oportunidade de observar divisões de células-tronco neurais assimétricas em condições próximas a um contexto fisiológico. A primeira parte do nosso protocolo introduz nossa abordagem sobre a dissecação de cérebros larvais. Como já dito13, um aspecto crítico da preparação é evitar danificar o cérebro. O aspecto mais desafiador disso é separar o cérebro dos discos imagináveis vizinhos sem puxar excessivamente o cérebro. Nossa abordagem para "cortar sem puxar" é realizar um movimento de moagem com as pontas de um par de fórceps, ou deslizar uma ponta de fórceps ao longo de duas outras pontas de fórceps segurando a conexão entre tecidos(Figura 1A) enquanto Lerit et al. descrevem movimentos semelhantes a serras com um pino dissecando. Aconselhamos o experimentador a tentar todas as abordagens e a adotar a mais adequada para si. Também sugerimos o uso de pontas de pipeta revestidas de BSA ou FCS em vez de ferramentas de dissecção para transferir cérebros isolados. O revestimento impede que os tecidos grudem no plástico e permite a transferência segura de tecidos, mantendo-os sempre completamente imersos, sem submá-los a uma possível deformação transitória, pois se apegam à ferramenta de dissecção durante a transferência. As pontas revestidas têm outras vantagens para permitir a transferência de vários cérebros ao mesmo tempo, o que é particularmente útil quando é fundamental controlar o tempo de residência das amostras dentro de um determinado meio; são adequados para a transferência de outros tecidos, mesmo os frágeis como, por exemplo, corpos de gordura; eles podem acomodar uma ampla gama de diferentes tamanhos de amostra usando pontas maiores ou cortando a extremidade da ponta.
Em seguida, este protocolo descreve o uso de coagulação de fibrinogênio para imobilizar cérebros larvais na tampa de um prato de cultura. Um cérebro é orientado dentro de uma gota de cultura média + Fibrinogen, após o qual a coagulação é induzida pela adição de Trombina. A formação de fibrina é gradual, proporcionando uma janela de tempo durante a qual a orientação da amostra pode ser ajustada, se necessário(Figura 2C). Se for necessária uma leve compressão da amostra - que aconselhamos no caso de cérebros larvais - ela também pode ser ajustada bem pressionando o coágulo mais ou menos perto da amostra durante as etapas 3.4.4 e 3.5.2. A principal vantagem deste fibrinogênio coagulando sobre o protocolo descrito em Lerit et al., em que os cérebros são montados entre uma membrana permeável a gás e uma mancha de cobertura, é a capacidade de substituir o meio de cultura durante a imagem ao vivo. Uma possível vantagem de usar uma membrana permeável a gás sobre nosso protocolo pode ser que ele fornece uma oxigenação ideal das amostras, que poderia ser mais limitada com nossa abordagem à medida que os cérebros são separados do ar pelo coágulo e algum meio. Por essa razão, embora não tenhamos avaliado o efeito da quantidade de cultura média dentro do prato de cultura, sugerimos limitar a quantidade de cultura média em cima dos coágulos, mantendo os coágulos completamente imersos.
Como a manipulação dos coágulos pode ser experimentalmente difícil e demorada, recomendamos que o experimentador primeiro pratique manipular coágulos sem amostras. Modulando o volume da queda do meio de cultura + Fibrinogênio na tampa, a concentração de Fibrinogen ou o volume e concentração de Trombina poderia ajudar a facilitar a preparação e poderia ser importante ao adaptar o protocolo a outros tipos de tecidos. Com experiência suficiente manipulando os coágulos, vários cérebros podem ser imobilizados em um coágulo, se necessário, embora complica o ajuste fino da orientação. Vários coágulos podem ser formados no deslizamento de tampas, permitindo, por exemplo, imagens de amostras de diferentes genótipos. Também é possível expor diferentes coágulos na mesma cobertura para diferentes meios culturais, embora tenha que ser tomado cuidado para nunca misturar as gotas do meio cultural que cobre os diferentes coágulos. Uma vez que os cérebros larvais estejam imobilizados e prontos para imagens ao vivo, aconselhamos seguir as recomendações de Lerit et al.13 para evitar fotodamagem excessiva. Só adicionamos a essas recomendações para não apenas manter os cérebros a 25 °C durante a imagem ao vivo com uma incubadora de estágio, mas também para pré-aqueça esta etapa por pelo menos 30 minutos antes do início da imagem. Em nossas mãos, não fazê-lo sistematicamente resulta em um forte foco à deriva.
Pode ser vantajoso em alguns contextos ser capaz de realizar microscopia correlacionada e corrigir e imunossuir uma amostra após a imagem viva. No entanto, uma limitação do uso de coágulos fibrinas é que é quase impossível isolar mecanicamente um cérebro de um coágulo sem danificá-lo. Uma possível maneira de superar essa limitação poderia ser desenvolver métodos para degradar coágulos fibrinas com Plasmin ou induzir a desmontagem do coágulo por adição de um peptídeo imitando os botões permitindo a polimerização fibrina28. Normalmente usamos coágulos fibrinos em amostras que variam de células únicas a tecidos longos de 200 μM, mas também poderíamos imobilizar com sucesso em coágulos e cérebros de imagem de abelhas adultas com mais de 3 mm de largura. O limite superior do tamanho da amostra que pode ser imobilizado em coágulos permanece a ser determinado. Da mesma forma, embora normalmente imagem amostras imobilizadas por 4 a 5 h, nós visualizamos com sucesso neuroblastos na cultura primária por até 3 dias, indicando que o coágulo pelo menos não interfere com a viabilidade a longo prazo. Pelo contrário, os coágulos podem facilitar a substituição regular do meio, requisito para imagens de longo prazo, sem a necessidade de dispositivos como bombas peristálticas para este fim. Embora não tenhamos medido os parâmetros de permeabilidade dos coágulos fibrinos, a natureza fibrosa em gel dos coágulos parece ser penetrável por moléculas permeáveis celulares. Descobrimos que Latrunculin A, Colcemid ou 1-NAPP1, ligantes HALO-tag e outros corantes padrão usados na biologia celular atingem as células no coágulo fibrina sem qualquer problema e até agora não encontraram moléculas que seriam retidas pelo coágulo, o que, no entanto, é uma possibilidade que precisa ser testada empiricamente.
Em conclusão, o uso de coágulos fibrinas fornece uma maneira confiável e relativamente fácil de implementar uma maneira de imobilizar tecidos vivos para imagens vivas. Além de sua utilidade em limitar a deriva lateral, a capacidade de mudar o meio cultural durante a imagem ao vivo tem se mostrado inestimável para nossa abordagem genética química para estudar a divisão celular assimétrica dos neuroblastos de D. melanogaster 21. Prevemos que essa técnica será benéfica para estudos em uma ampla gama de tecidos diferentes, particularmente se envolvem genética química ou, por exemplo, auto-rotulagem deproteínas 29.
Nossa macro MultiHyperStackReg conta com o plugin TurboReg ImageJ, que alinha quadros sucessivos ou fatias de uma pilha, e o plugin MultiStackReg ImageJ, que permite aplicar as transformações a outras pilhas. O MultiHyperStackReg simplesmente permite aplicar essas transformações a hiperséscimos (pilhas com pelo menos quatro dimensões). Como o uso do MultiHyperStackReg, como o descrevemos, requer muitas ações e pode ficar bastante demorado, também escrevemos a macro AutoHyperStackReg, que executa automaticamente todas as etapas descritas nas etapas 6.2 e 6.3. No entanto, ao contrário do MultiHyperStackReg, o AutoHyperStackReg atualmente não tem a possibilidade de calcular o alinhamento de uma pilha com base em uma sub-região desta pilha, uma opção que encontramos às vezes é crucial para um alinhamento satisfatório. Outra limitação do AutoHyperStackReg é que seu uso está restrito a traduções e não às outras transformações propostas pelo TurboReg e MultiStackReg, enquanto o MultiHyperStackReg pode se aplicar a um hiperstruo qualquer tipo de transformação caso o usuário precise. Futuras versões implementarão essas funções e estarão disponíveis no GitHub30. Finalmente, nossa macro de linhas rotativas fornece uma maneira fácil de medir rapidamente sinais corticais em lapsos de tempo, mesmo que o córtex mude sua posição ou orientação ao longo do tempo. Se seu modo de rastreamento ou seu modo de não rastreamento é mais adequado para análise depende da qualidade e consistência do sinal cortical. O modo de rastreamento é mais fácil de usar, pois o usuário não precisa considerar onde o córtex estará para cada ponto de tempo e pode acomodar grandes mudanças de posição e orientação ao longo do tempo. No entanto, só é adequado se o sinal cortical permanecer forte o suficiente para ser detectado durante todo o filme: uma falha em detectar qualquer outra coisa que não seja o córtex (por exemplo, um compartimento citoplasmático brilhante perto do córtex) pode comprometer a detecção para cada ponto de tempo seguinte (por exemplo, o compartimento citoplasmático se afasta do córtex e as linhas corticais podem segui-lo para o resto do lapso de tempo). O modo de não rastreamento não tem essa armadilha, pois a detecção é limitada à linha originalmente desenhada pelo usuário (por exemplo, um compartimento citoplasmônico brilhante pode fazer com que a detecção falhe por alguns pontos de tempo, mas à medida que o compartimento citoplasmônico se afasta da zona de detecção, a detecção adequada do córtex retoma), mas não se comporta bem se a posição córtex ou orientação mudar muito ao longo do tempo. O próximo recurso (que estará disponível no GitHub30) a ser desenvolvido para o modo de rastreamento será a opção de analisar apenas os pontos de tempo especificados e definir um ponto de tempo de referência (em vez do primeiro ponto de tempo) antes do qual e depois da qual a detecção será realizada, o que permitirá ao usuário pelo menos evitar pontos de tempo problemáticos.

A drosophila continua sendo um importante sistema modelo para estudar uma vasta gama de questões biológicas e tem se destacado no avanço do conhecimento em muitas disciplinas por décadas. Uma característica que o faz particularmente se destacar é que ele é especialmente adequado para imagens ao vivo. A capacidade de monitorar processos subcelulares ou o comportamento de células e tecidos em tempo real continua contribuindo para gerar conceitos-chave relevantes para a biologia celular e de desenvolvimento. Muitos protocolos bem sucedidos foram desenvolvidos por diferentes grupos para manter tais amostras de Drosophila vivas e saudáveis para estudar o comportamento do espécime e moléculas fluorescentes vivas. Órgãos e tecidos da mosca, como discos imagináveis1,2, o cérebro larval3,4,5,6, ou câmaras de óvulos de fêmeas adultas7,8,9, ou o intestino adulto10, por exemplo, podem ser extraídos e mantidos em cultura para imagem com microscopia de lapso de tempo. Um desafio fundamental para a imagem ao vivo é garantir que a amostra seja mantida perto da superfície de imagem para uma resolução ideal e imóvel sem comprometer a integridade da amostra que pode ser sensível a impactos mecânicos. Estudar células-tronco neurais, chamadas neuroblastos ou neurônios no cérebro larval de Drosophila, por exemplo, manter amostras próximas à superfície de imagem pode ser alcançada cobrindo-as com mídia cultural em câmaras de imagem seladas11,12,13. No entanto, essa abordagem não permite facilmente a troca de mídia, limitando assim o espaço experimental para manobras. Alternativamente, as amostras podem ser preparadas e colocadas em tampas tratadas para aumentar a adesão das células e permitir microscopia de visitação de vários pontos e imagens estendidas de células vivas em pratos de cultura aberta, que potencialmente permitem a troca de mídia, mas não fornecem meios fáceis para evitar a deriva ou perda de amostras durante a troca de mídia14,15.
O método de coágulo fibrin originalmente desenvolvido para estudar a meiose em espermatos vivos de mosca-de-guindaste16 é especificamente adequado para superar esses problemas. O fibrinogênio é dissolvido em meio de cultura relevante, as amostras colocadas e orientadas em uma gota desta solução em uma câmara de imagem adequada de superfície de vidro antes da adição da Trombina, resultando na rápida formação de um coágulo fibrin insolúvel, uma malha fibrosa pegajosa que adere à superfície do vidro e às amostras, garantindo o acesso da amostra ao meio da cultura. O meio pode então ser trocado sem perturbar o coágulo ou a posição da amostra. A troca média de cultura durante a imagem é, por exemplo, desejável quando os inibidores devem ser adicionados como no método original ou para experimentos de lavagem ou perseguição de pulso ou quando corantes fluorescentes devem ser adicionados durante a imagem de células vivas, mantendo células e tecidos no lugar. Coágulos fibrinos são adequados para a imagem de tecidos drosophila, bem como células individuais13,17. Coágulos fibrinos podem ainda ser usados para ajudar a orientar amostras, que devido à sua forma ou outras propriedades normalmente não seriam orientadas da maneira desejada, modulando a posição da amostra dentro do coágulo fibrina e a forma do próprio coágulo.
Aqui fornecemos uma atualização sobre nossos métodos atuais de imagem baseados em coágulos fibrinas e fornecemos ferramentas para análise de imagem baseada em segmentação e focamos no uso deste método para estudar divisões de neuroblastos no cérebro de mosca em desenvolvimento. Usamos rotineiramente o método de coágulos fibrinas para seguir várias amostras em diferentes coágulos no mesmo prato de cultura. Isso permite i) imagens de eventos subcelulares como comportamento central ou localização mRNA ao vivo18,19, ii) monitorando o comportamento das amostras após o tratamento farmacológico de diferentes genótipos sob as mesmas configurações de imagem usando micros visitantes multipontos20, iii) estudar os efeitos da inibição aguda das enzimas21 e iv) minimizando a deriva para estudar mudanças na orientação da divisão celular das células dentro de seu ambiente fisiológico sobre a ablação alaser-alvo 22. Enquanto efeitos indesejados de Trombina e Fibrinogênio e o coágulo fibrinão precisam ser testados empiricamente para cada amostra, este método é, em princípio, adequado para imobilizar qualquer tipo de amostra que deve ser analisada por imagens de células vivas e em Drosophila tem sido usada com sucesso para estudar múltiplos aspectos da biologia dos neuroblastos5,19,20, mas também a dinâmica das projeções citosensoras das células-tronco da linha germina feminina23 e mudanças na polaridade sobre a inibição aguda de células folículos de Drosophila
A imagem fluorescente de lapso de tempo resulta na geração de complexos conjuntos de dados 3D resolvidos pelo tempo que requerem métodos para extrair essas informações quantitativas. Aqui descrevemos nosso desenvolvimento adicional de24 macros baseadas em ImageJ que podem ser usadas para corrigir para deriva em hipersobras e macros ImageJ personalizadas que permitem quantificação semi-automatizada de fluorescência multicanal no córtex celular desenvolvido para quantificar proteínas corticais em neuroblastos de cérebros larvais Drosophila ou de neuroblastos individuais na cultura celular primária.

<table><tbody><tr><td>Albumin bovine serum, BSA</td><td>Merck</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen from human plasma</td><td>Sigma</td><td>F3879</td><td></td></tr><tr><td>FluoroDish Cell Culture Dish - 35mm, 23 mm well</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>PP1 Analog (1NA-PP1)</td><td>Merck Millipore</td><td>529579</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex spot plate with nine depressions</td><td>Sigma</td><td>CLS722085-18EA</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&#039;s Insect Medium</td><td>Sigma</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin from bovine plasma</td><td>Merck</td><td>T4648</td><td></td></tr></tbody></table>

applications of immobilization of drosophila tissues with fibrin clots for live imaging

A drosophila é um importante sistema modelo para estudar uma vasta gama de questões biológicas. Vários órgãos e tecidos de diferentes estágios de desenvolvimento da mosca, como discos imagináveis, o cérebro larval ou câmaras de óvulos de fêmeas adultas ou o intestino adulto podem ser extraídos e mantidos em cultura para imagem com microscopia de lapso de tempo, fornecendo insights valiosos sobre a biologia celular e de desenvolvimento. Aqui, descrevemos em detalhes nosso protocolo atual para a dissecção de cérebros larvais de Drosophila, e então apresentamos nossa abordagem atual para imobilizar e orientar cérebros larvais e outros tecidos em uma mancha de vidro usando coágulos fibrinos. Este método de imobilização requer apenas a adição de Fibrinogen e Trombina ao meio da cultura. É adequado para imagens de lapso de tempo de alta resolução em microscópios invertidos de múltiplas amostras no mesmo prato de cultura, minimiza a deriva lateral frequentemente causada por movimentos do estágio microscópio em microscopia visitante de vários pontos e permite a adição e remoção de reagentes durante o curso da imagem. Também apresentamos macros personalizadas que usamos rotineiramente para corrigir para deriva e para extrair e processar informações quantitativas específicas a partir da análise de lapso de tempo.

Imobilização de tecidos de Drosophila com coágulos fibrinas e média de cultura de troca durante a imagem ao vivo. Após ser dissecado após o procedimento apresentado na etapa 2 (Figura 1) e imobilizado em coágulos fibrinas no mesmo deslizamento de cobertura após o procedimento apresentado na etapa 3 (Figura 2),cérebros larvais expressando Bazooka marcada por GFP (Baz::GFP), o ortolog de mosca da proteína polaridade Par-3, foram imageados por 30 minutos em imagens multi-posicionais de lapso de tempo. Baz::GFP é combinado com apkcas4, um alelo que permite a inibição aguda da proteína atípica quinase C (aPKC) através da adição do pequeno ATP analógico 1-NAPP120. 1-NAPP1 foi, portanto, adicionado ao meio cultural após o procedimento apresentado na etapa 4 e a imagem viva foi retomada por 2,5 h. Cérebros de controle que carregam uma versão selvagem do aPKC quinase não reagiram ao análogo ATP, enquanto cérebros portadores adicionalmente de uma mutação sensível a analógica de aPKC (apkcas4) exibiram uma contração do neuroepithelium e aglomerados brilhantes de Baz em neuroblastos e sua prole ( Figura6, Vídeo 1). Os neuroblastos continuam se dividindo ao longo do lapso de tempo, indicando que o tecido permanece saudável, e os cérebros mostram pouca deriva apesar da mudança média cultural, indicando que eles estão bem imobilizados. Da mesma forma, após serem dissecadas após o procedimento apresentado em27,os ovários expressando Baz::GFP foram imobilizados em coágulos fibrinas no mesmo deslizamento de tampas e imageados por 8 min, após o qual a aplicação de 1-NAPP1 induziu a contração de células foliculares mutantes apkcas4, mas não de controles(Figura 7, Vídeo 2).
Correção de drift lateral e de foco usando MultiHyperstackReg. Um hipersoante exibindo deriva lateral e de foco(Vídeo 3, painel esquerdo) foi primeiro corrigido para deriva lateral (passo 6.2, Figura 3, Vídeo 3, painel médio), depois o drift de foco (passo 6.3, Figura 4, Vídeo 3, painel direito) usando o plugin MultiStRegack e a macro MultiHyperstackReg, resultando em uma redução substancial dos movimentos observados no hiperstack original.
Medição de sinal cortical usando linhas rotativas Um neuroblasto expressando Baz::GFP (verde) e a proteína transmembrana CD4 marcada com uma proteína fluorescente infravermelha (CD4::mIFP, vermelho) foi imageado durante uma mitose. O sinal CD4::mIFP foi usado como referência para detectar o córtex em várias partes do neuroblasto com tubos de linha (etapa 7, Figura 5, Figura 8A-C) e o sinal Baz::GFP foi medido nas posições detectadas Figura 8D). Durante sua divisão, os neuroblastos se polarizaram transitoriamente estabelecendo domínios corticais distintos e opostos: o polo apical e o polo basal. Baz define o polo apical e, consistentemente, o sinal baz::GFP aumentou no polo apical do neuroblasto e diminuiu no polo basal durante a divisão (Figura 8C,D). A posição do córtex foi rastreada satisfatoriamente ao longo do lapso de tempo (Figura 8C, Vídeo 4). As linhas e genótipos de Drosophila são referenciados na Tabela Suplementar 1-2.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig06.jpg"> Figura 6: Aplicação de um análogo ATP em cérebros larvais imobilizados durante a imagem ao vivo. (A) Imagem ao vivo de dois cérebros larvais expressando Baz::GFP imobilizado no mesmo deslizamento de tampa. O meio de cultura é alterado para uma concentração de 10 μM do ATP analógico 1-NAPP1 em 0 min. Os cérebros de controle não reagem visivelmente ao análogo ATP, enquanto os cérebros portadores de uma mutação sensível analógica de aPKC (aPKCAS4) exibem uma contração do neuroepithelium (pontas de flecha) e aglomerados brilhantes de Baz em neuroblastos e sua descendência. Projeção de intensidade máxima de 33 fatias para uma profundidade de 23 μM. Barra de escala: 20 μM. (B) Ampliação do neuroepithelium. Barra de escala: 10 μM. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61954/61954fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig07.jpg"> Figura 7: Aplicação de um análogo ATP em câmaras de ovos imobilizadas durante a imagem ao vivo. Imagem ao vivo de dois ovários expressando Baz::GFP imobilizado no mesmo deslizamento de tampa. O meio de cultura é alterado para uma concentração de 10 μM do ATP analógico 1-NAPP1 em 0 min. As câmaras de ovos de controle não reagem visivelmente ao análogo ATP, enquanto as câmaras de ovos que carregam uma mutação sensível analógica de aPKC (aPKCAS4) exibem uma contração do epitélio (pontas de flecha) eventualmente levando à aparente quebra das junções de aderentes. Projeção de intensidade máxima de 33 fatias para uma profundidade de 27 μM. Barra de escala: 20 μM. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61954/61954fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig08.jpg"> Figura 8: Medição do sinal cortical utilizando linhas rotativas. (A) Neuroblasto de D. melanogaster ao vivo expressando Baz::GFP (verde) e CD4::mIFP (vermelho). Linhas de ciano: linhas de varredura iniciais traçadas perpendicularmente para várias zonas corticais para medir. Barra de escala: 5 μM. (B) Identificação do córtex (linha azul escuro) utilizando linhas corticais e CD4::mIFP (vermelho) como canal de referência. Linha ciano: área definida pelo parâmetro "Medir ao redor" (aqui, 2 pixels), onde o sinal é medido após a detecção do córtex. Barra de escala: 2 μm. (C) Cyan: áreas corticais identificadas durante uma divisão de neuroblasto pelo método de linha rotativa das linhas de varredura iniciais exibidas em (A), usando CD4::mIFP (vermelho) como canal de referência. Barra de escala: 5 μM. Seta: polo apical. Ponta de flecha: polo basal. (D) Medição da intensidade do sinal Baz::GFP ao longo do tempo nas duas zonas correspondentes identificadas por linhas rotativas exibidas em(C). Durante a mitose, Baz::GFP é transitoriamente enriquecido no polo apical do neuroblasto e é esgotado do polo basal oposto. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61954/61954fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Vídeo 1: Aplicação de troca de mídia em cérebros larvais imobilizados durante a imagem ao vivo para adicionar um inibidor, apresentado na Figura 6, barra de escala: 20 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_1_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Vídeo 2: Aplicação de troca de mídia em câmaras de óvulos imobilizadas durante a imagem ao vivo para adicionar um inibidor, apresentado na Figura 7, barra de escala: 20 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_2_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Vídeo 3: Correção de drift lateral e de foco usando MultiHyperStackReg. Imagem ao vivo de um neuroblasto expressando a sonda de membrana PH::GFP. Xy: plano focal único. Xz: reslice ortogonal. Esquerda: antes da correção da deriva. Meio: após a correção da deriva lateral. Direito: após a correção lateral e o drift de foco, barra de escala: 10 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_3_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Vídeo 4: Detecção do córtex usando linhas rotativas, apresentadas na Figura 8, barra de escala: 5 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_4_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Tabela Suplementar 1: Genótipos de tecidos Drosophila imaged. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_1_genotypes.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela Suplementar 2: Origem dos transgenes usados. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_2_origine_of_transgenes.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Arquivo de codificação suplementar 1: Origem dos transgenes usados. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code1_MultiHyperstackReg.ijm" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo de codificação suplementar 2: Origem dos transgenes usados. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code2_AutoHyperstackReg.ijm" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo de codificação suplementar 3: Origem dos transgenes usados. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code3_RotatingLineScan.ijm" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Este protocolo descreve aplicações de imobilização de amostras usando coágulos fibrinas, limitando a deriva e permitindo a adição e lavagem de reagentes durante a imagem ao vivo. As amostras são transferidas para uma gota de Fibrinogênio contendo meio de cultura na superfície de um deslizamento de cobertura, após o qual a polimerização é induzida pela adição de trombina.

Aplicações de imobilização de tecidos drosophila com coágulos fibrinas para imagem ao vivo

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

applications-immobilization-drosophila-tissues-with-fibrin-clots-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

3.0K visualizações.  University of Dundee. Este protocolo descreve aplicações de imobilização de amostras usando coágulos fibrinas, limitando a deriva e permitindo a adição e lavagem de reagentes durante a imagem ao vivo. As amostras são transferidas para uma gota de Fibrinogênio contendo meio de cultura na superfície de um deslizamento de cobertura, após o qual a polimerização é induzida pela adição de trombina.

Vídeo: Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

O uso de chips microfluídicos para Imagens ao vivo e estudo das respostas Lesão em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Bioengenharia

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

Visualizando o Live Drosophila Junção neuromuscular-Glial com corantes fluorescentes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Biologia

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Elaboração de Drosophila Os embriões para Live-Imaging Usando o protocolo gota suspensa

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Preparação de Desenvolvimento e Adultos Drosophila Brains e retina de imagens ao vivo

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

Na imagem in vivo de larvas Drosophila Intact no Sub-celular Resolução

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

Na Vivo Único-molécula de rastreamento no Terminal do nervo Motor pré-sináptica da drosófila

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Neurociência

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Fluorescência de célula única resolução vivo Imaging de Drosophila relógios circadianos em cultura cérebro Larval

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Imagens ao vivo de Proteínas GFP-rotulados em<em&gt; Drosophila</em&gt; Oócitos

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA, um método para montagem de larva drosophila para imagem de lapso de tempo de longo prazo

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...

Aplicações de imobilização de tecidos drosophila com coágulos fibrinas para imagem ao vivo

Resumo

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Capítulos neste vídeo

O uso de chips microfluídicos para Imagens ao vivo e estudo das respostas Lesão em