Este estudo apresenta um protocolo para a diferenciação de células precursoras neurais induzidas apenas pela estimulação de pulso de corrente direta em um sistema microfluido. Esta técnica fornece uma abordagem benéfica para reduzir o tempo de configuração experimental, o volume da amostra e o volume do reagente. Além disso, o chip MOE é adequado para observações de microscopia confocal.
O simples tratamento de pulso de corrente direta pode controlar o destino das células precursoras neurais do camundongo e pode ser usado para desenvolver estratégias terapêuticas para distúrbios do sistema nervoso. Para começar, desenhe padrões para camadas pmma individuais e a fita de dupla face usando software apropriado. Ligue o escriba laser de dióxido de carbono e conecte-o a um computador pessoal.
Abra o arquivo de padrão projetado usando o software. Coloque as folhas pmma ou fita dupla face na plataforma do escribra laser e, em seguida, concentre o laser na superfície das folhas pmma ou na fita de dupla face usando a ferramenta de foco automático. Selecione o escriba laser como a impressora e use o escriba laser para iniciar a ablação direta na folha pmma ou fita dupla face.
Remova a película protetora das folhas pmma e limpe a superfície usando gás nitrogênio. Para unir várias camadas de folhas pmma, empilhe três pedaços de folhas pmma de um milímetro e uni-las sob uma pressão de cinco quilos por centímetro quadrado em um conector térmico por 30 minutos a 110 graus Celsius para formar o fluxo ou o conjunto do canal de estimulação elétrica. Adere 12 peças de adaptadores às aberturas individuais na camada um do conjunto de chips MOE com cola cianoacrilato de ação rápida.
Desinfete os substratos PMMA de um milímetro, a fita de dupla face e o PMMA de grau óptico de três milímetros usando irradiação ultravioleta por 30 minutos antes de montar o chip. Adere aos substratos PMMA de um milímetro no PMMA de grau óptico de três milímetros com a fita de dupla face para completar o conjunto PMMA. Adere o vidro de cobertura limpo ao conjunto PMMA com a fita de dupla face.
Sele as aberturas dos adaptadores da ponte ágar com plugues brancos apertados. Conecte o conector inferior plano ao conjunto do chip MOE através dos adaptadores de entrada e saída médias e, em seguida, conecte o adaptador Luer cone às torneiras de três vias. Adicione dois mililitros de solução PLL de 0,01% usando uma seringa de três mililitros que se conecta à torneira de três vias da entrada média, e conecte uma seringa vazia de três mililitros à torneira de três vias da tomada média.
Encha as regiões de cultura celular com a solução PLL e bombeie lentamente a solução de revestimento para frente e para trás. Feche as duas torneiras de três vias para selar a solução dentro das regiões culturais. Incubar o chip MOE a 37 graus Celsius durante a noite em uma incubadora cheia de atmosfera de dióxido de carbono de 5%.
Abra as duas torneiras de três vias e limpe bolhas nos canais bombeando manualmente a solução de revestimento para frente e para trás no canal usando as duas seringas. Desenhe três mililitros de meio completo em uma seringa de três mililitros que se conecta à torneira de três vias da entrada média e adicione-a para substituir a solução de revestimento nas regiões de cultura celular. Substitua o plugue branco com o adaptador Luer e injete 3% de agarose quente para encher o adaptador.
Conecte a seringa de bloqueio Luer ao adaptador Luer e injete 3% de agarose quente através do bong de borracha preto para encher a seringa de bloqueio Luer. Deixe de 10 a 20 minutos para que a agarose esfrie e solidifique. Instale o chip MOE semeado de célula no aquecedor ITO transparente que é fixado em um estágio motorizado XYZ programável mantido a 37 graus Celsius.
Infundir os mNPCs bombeando manualmente para dentro do chip MOE através da tomada média e, em seguida, incubar o chip MOE semeado celular no aquecedor ITO por quatro horas. Use fios elétricos para conectar um multiplexer EF ao chip MOE através dos eletrodos do chip. Conecte um multiplexer EF e um gerador de função a um amplificador para saída de pulsos DC de onda quadrada.
Remova todos os conectores e adaptadores de fundo plano no chip MOE e encha os adaptadores com PBS e, em seguida, sele as aberturas do adaptador com parafilm. Após a imunostenção, observe as células usando um microscópio de fluorescência confocal. A estimulação de pulso DC resultou em mNPCs simultâneos diferenciando-se em neurônios, astrócitos e oligódendrocitos no meio de manutenção de células-tronco.
Os percentuais de neurônios, astrócitos e oligodenrócitos no grupo controle e no grupo de estimulação são mostrados aqui. Após o tratamento de pulso dc, os mNPCs expressaram um número significativamente alto de neurônios em DIV sete, astrócitos em DIV três, e oligodendrocitos em DIV sete e DIV 14 estavam presentes em níveis relativamente mais altos nos grupos de estimulação do que no grupo controle. Neuroesferas formadas por 30 a 40 células são preferidas para iniciar a diferenciação do MNPC.
O crescimento excessivo de mNPCs prejudicará a sobrevivência celular durante o processo de diferenciação.
