Agradecemos a Thomas Wang por desenvolver o protótipo de filamentos von Frey, Patrick J. Huang por melhorar o ensaio da sonda mecânica, o Bloomington Drosophila Stock Center para o controle (w1118) e ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP, e os membros do laboratório Galko para ler criticamente o manuscrito. Este trabalho foi apoiado por R21NS087360 e R35GM126929 para MJG.

1. Construção de sonda mecânica
<ol><li>Corte cada filamento nitinol(Figura 1B),perpendicular ao seu eixo longo, ao comprimento especificado(Figura 1M-N) utilizando um pequeno cortador de arame(Figura 1C). Os filamentos vêm em três diâmetros pré-definidos diferentes(Figura 1B). NOTA: Os comprimentos especificados aqui são um guia para alcançar as pressões aproximadas indicadas, utilizando um protocolo semelhante para a construção da montagem. Em última análise, independentemente do comprimento do corte do filamento e da profundidade do orifício na montagem, os filamentos devem ser medidos/calibrados em um equilíbrio para obter o valor exato de força/pressão.</li>
	<li>Examine a ponta do filamento sob um estereótipo para garantir que não permaneçam bordas afiadas ou irregulares, pois estas podem causar danos teciduais à pele das larvas e interferir na calibração.</li>
	<li>Alise manualmente as bordas afiadas da sonda mecânica usando uma pedra de afiação até que não persistam irregularidades nítidas(Figura 1D).</li>
	<li>Faça um buraco na extremidade de um palito de picolé de madeira(Figura 1E) usando uma agulha hipodérmica (ver Tabela de Materiais). Insira a agulha pelo menos na metade da altura do palito de picolé(Figura 1E). Isso cria uma câmara para inserção do filamento nitinol.</li>
	<li>Aplique cola de madeira em um único filamento de nitinol(Figura 1F)e insira o filamento revestido de cola na ranhura da agulha em um palito de picolé de madeira(Figura 1G). Deixe secar por ~5 h.</li>
	<li>Calibrar cada sonda mecânica pressionando-a contra uma balança até que a sonda mecânica dobre(Figura 1H-L). Este é o ponto de força máxima que pode ser registrado em gramas. Dependendo dos diâmetros do filamento (pré-definido) e comprimentos (determinados pelo usuário) uma gama completa de forças e pressões pode ser gerada.</li>
	<li>Converta a massa registrada na etapa 1.6 para forçar em millinewton (mN) usando a fórmula f = ma (A força é igual à massa multiplicada pela aceleração gravitacional). f: força; m: massa; a: aceleração gravitacional (9,8 m/s2) (Figura 1M).</li>
	<li>Por fim, converta a força calculada em pressão (força/área) em quilopascal (kPa) dividindo a força medida pela área superficial da ponta do filamento(Figura 1M). Para calcular a área, converta o diâmetro dos diferentes filamentos de nitinol de polegadas (0,04", 0,06 e 0,08") em centímetros. Em seguida, πr2 (onde, r = o raio de filamento nitinol) determina a área (ver Figura 1M). A preparação de várias sondas usando filamentos de diferentes diâmetros e comprimentos gerará um conjunto completo abrangendo a faixa responsiva das larvas de Drosophila (conjunto amostral mostrado na Figura 1N). NOTA: Verifique cada sonda mecânica pelo menos a cada 3-4 semanas. Quando a pressão se desvia em mais de ± 3% da medida original, uma nova sonda mecânica deve ser fabricada.</li>
</ol>2. Preparação de larvas
<ol><li>Aumentar a cepa de controle(w1118) progêneria larva ou larvas contendo o transgenes ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP (para visualizar danos aos neurônios sensoriais) em alimentos padrão em uma incubadora de 25 °C. Normalmente, os estoques são mantidos rotineiramente a 18 °C, mas tanto os pais quanto os filhotes larvais são criados a 25 °C em alimentos padrão de farinha de milho para experimentos. NOTA: Moscas adultas (cinco machos e dez fêmeas, proporção 1:2) são mantidas nos frascos de mosca, para permitir a colocação de ovos, por cerca de 24 h. O tempo após a colocação do ovo (AEL) começa a partir de quando os adultos são removidos.</li>
	<li>Colete a terceira larva instar, depois de aproximadamente 96 h de colocação de ovos, esguichando suavemente a água da torneira para o alimento de mosca macia contendo as larvas. Larvas errantes que deixaram a comida, ou que já se formaram em espirros anteriores ou posteriores, são muito grandes/velhas para este ensaio. As segundas larvas instar (~ menos de 4 mm de comprimento) são muito pequenas.</li>
	<li>Despeje o conteúdo do alimento de mosca macia em uma placa Petri de tamanho padrão limpo (100 mm x 15 mm).</li>
	<li>Usando fórceps, classificar o meio do terceiro instar, tamanho médio, larvas (ver Figura 2A) de larvas menores (segunda instar e terceira instar) ou larvas maiores (tardia ou errante terceira estrela). Recomenda-se manipulação suave com fórceps para evitar qualquer dano tecidual às larvas. NOTA: A transferência utilizando fórceps é baseada principalmente na tensão da água e não aplicando pressão nas larvas com as lâminas dos fórceps. Uma alternativa ao uso de fórceps para manobras de larvas são pincéis de tinta macia. Com qualquer ferramenta, o usuário deve praticar a transferência dos animais, para não causar danos teciduais não intencionais que possam complicar as medidas comportamentais.</li>
	<li>Transfira o terço médio das larvas instar, usando fórceps, para uma pequena placa de Petri (30 mm x 15 mm) contendo um pequeno plugue de alimentos de mosca umedecidos com água em temperatura ambiente. Mantenha as larvas na pequena placa de Petri até que os experimentos sejam realizados, mas não mais do que 20 minutos. NOTA: Geralmente, a transferência de 20 a 30 larvas para o plugue alimentar dará um número adequado para 20 minutos de ensaios comportamentais.</li>
</ol>3. Ensaio de nocicepção mecânica
<ol><li>Coloque uma larva instar de meio terço (usando fórceps) em uma almofada fina de vinil preto ou escuro sob um estereóscópio de campo brilhante. A cor escura proporciona contraste que melhora a visualização da larva. É preferível ter um pedaço livremente móvel de vinil escuro porque permite ao usuário alinhar a larva sem tocá-la ou machucá-la.</li>
	<li>Coloque as luzes de fibra óptica entre as lentes objetivas do microscópio e a almofada de vinil preto ou escuro; isso permitirá uma iluminação adequada de alto contraste para ver a larva.</li>
	<li>Descarte larvas que não apresentem locomoção normal após a transferência para a almofada. Estes podem interferir com a resposta comportamental nociceptiva normal. Para locomoção normal, consulte Vídeo 1.</li>
	<li>Limpe, usando uma toalha de papel, qualquer excesso de água ao redor da larva que possa fazer com que a larva flutue na almofada de vinil.</li>
	<li>Oriente a larva movendo a almofada de vinil escuro. A cabeça/boca da larva deve apontar para a esquerda se você for destro e vice-versa se você for canhoto(Figura 2A-B).</li>
	<li>Aplique a sonda mecânica escolhida, tipicamente para 1-2 s, no lado dorsal posterior da larva no segmento aproximadamente abdominal A8 (ver Figura 2B),até que a sonda dobre e provoque a quantidade de pressão previamente medida(Figura 2C). É importante que a sonda pressione contra a superfície dorsal da larva e comprime as larvas na almofada subjacente no ponto de contato da sonda. NOTA: No ponto de contato entre a ponta do filamento nitinol e a cutícula dorsal-epiderme, sondas inferiores a 2.300 kPa, dobram principalmente sem penetrar na cutícula e nos tecidos subjacentes. Tais sondas raramente afetam a mortalidade larval4. Em pressões mais altas (>5.000 kPa) as sondas dobram e, ocasionalmente, penetram na cutícula e nos tecidos subjacentes. A puncturação das larvas prejudica a sobrevivência larval4 e, se observadas, essas larvas são tipicamente descartadas a partir da análise comportamental.</li>
	<li>Regisso responsável por cada larva. Uma resposta nociceptiva positiva (Vídeo 2) é indicada se a larva mostra um rolo completo de 360° ao longo do eixo de seu corpo dentro de 3 s. Outras respostas (tentando girar, rastejar rápido e balançando) são consideradas negativas para os propósitos deste ensaio. NOTA: Larvas estimuladas com estímulo mecânico sublocante (200 kPa) não provocaram a resposta nociceptiva ou rolando típica(Vídeo 3). Algumas larvas apresentaram respostas rápidas para a frente ou de toque leve, como mudanças na direção do movimento.</li>
	<li>Descarte a larva e prepare a próxima para o ensaio, repetindo as etapas 3.1 a 3.7.</li>
	<li>Repetição de passos 3.1-3.7 até que o número desejado de larvas seja atingido (três a seis conjuntos de n = 10 larvas foram usadas aqui para cada sonda). NOTA: Ao usar sondas mecânicas de pressão mais baixa (174-462 kPa), o ensaio levará mais tempo por larva. Isso porque a ponta de filamentos mais longos oscila mais, tornando mais difícil cutucar a larva no centro do segmento A8. A prática é necessária com essas sondas.</li>
</ol>4. Microscopia confocal para avaliar morfologia neuronal
<ol><li>Coloque uma larva (de genótipo ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP para rotular neurônios sensoriais) previamente estimulada com um filamento de nitinol em uma câmara de etherização dentro de um frasco de Coplin contendo um béquer de 10 mL carregando uma bola de algodão encharcada com ~1 mL de éter dietil. Deixe a larva sentar na câmara por ~5 min. NOTA: Um protocolo detalhado para etherização é fornecido em um estudo anterior publicado pelo nosso grupo12.</li>
	<li>Enxágüe a larva suavemente da câmara de etherização em uma pequena placa de Petri.</li>
	<li>Tenha pronto um slide de microscópio, duas pequenas tampas (22 x 22 mm) e um deslizamento de tampas longos (22 x 54 mm) (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Adicione pequenas gotas de solução de éter:óleo (proporção 1:5 de éter etílico à solução de óleo de halocarbono, consulte Tabela de Materiais) em ambas as extremidades do slide e, em seguida, coloque as pequenas tampas em cima das pequenas gotículas. Este arranjo cria uma pequena lacuna de espaço onde a larva pode caber. NOTA: Pressione as pequenas tampas contra o deslizamento do microscópio até que seja difícil escorregar.</li>
	<li>Adicione algumas gotas de solução de éter:óleo no meio do slide do microscópio e, em seguida, coloque a larva, usando fórceps, no centro do slide do microscópio (entre as pequenas tampas). Certifique-se de que o eixo anteroposterior da larva é paralelo ao lado curto do slide e que o lado dorsal está voltado para cima.</li>
	<li>Cubra as larvas com o longo deslizamento de cobertura colocado em cima da larva e as duas tampas menores. NOTA: Pressione generosamente a tampa longa até que a larva esteja quase plana.</li>
	<li>Segmento de imagem A8 da larva usando um microscópio confocal (ver Tabela de Materiais) usando comprimento de onda laser 488 (GFP). NOTA: Imagem da larva imediatamente porque a anestesia via éter desaparecerá rapidamente (~5-10 min) e a larva acordará e se moverá, o que complicará mais imagens.</li>
	<li>Capture imagens de pilha Z em uma resolução de 1024 x 1024 pixels usando uma abertura numérica de 20x (NA) 0,7 lente objetiva seca a 1x de zoom, tamanho da etapa de 1,5 μm.</li>
</ol>5. Quantitação de danos teciduais
<ol><li>Colete e converta as imagens de pilha da série Z, da seção 4.8, em uma única projeção Z (um achatamento de múltiplas imagens tiradas em diferentes planos focais em uma única imagem composta). Isso pode ser realizado usando software comercialmente disponível (por exemplo, Olympus Fluoview) ou qualquer plataforma de código aberto equivalente, por exemplo, Fiji/Image J. Salve a projeção Z única no formato TIFF.</li>
	<li>Abra o programa de análise de imagens Fiji/ImageJ.</li>
	<li>Clique em Arquivo, na barra de menu e selecione Abrir na janela que é exibida.</li>
	<li>Selecione a projeção de imagem única armazenada, salva no formato TIFF, a ser analisada.</li>
	<li>Clique em Editar, na barra de menu e selecione a opção Inverter na janela que é exibida.</li>
	<li>Clique na imagem, na barra de menu, em seguida, selecione Ajustar, na janela que é exibida e, finalmente, selecione a opção Brilho/Contraste.</li>
	<li>Selecione a opção Forma à mão livre na barra de ferramentas para medir a área da lacuna (se houver).</li>
	<li>Clique em Analisar, na barra de menu, e selecione a opção Medir. Isso mostrará a área da abertura ou ferida.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Painless,+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception.">Painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113 (2), 261-273 (2003).</li><li>Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pickpocket+is+a+DEG/ENaC+protein+required+for+mechanical+nociception+in+Drosophila+larvae.">Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae.</a> Current Biology. 20 (5), 429-434 (2010).</li><li>Lopez-Bellido, R., Himmel, N. J., Gutstein, H. B., Cox, D. N., Galko, M. 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Os autores não têm nada a revelar.

Modificamos um ensaio mecânico estabelecido1,2,16 utilizando sondas mecânicas personalizadas fabricadas a partir de filamentos de nitinol. Esta liga metálica nos permite usar filamentos de diâmetro menor que são apropriados para o tamanho das larvas de Drosophila. Monofilamentos baseados em linha de pesca dominaram o campo de nocicepção mecânica de moscas até as2,5,6,16. Nossos filamentos nitinol mantêm sua forma e mediram a pressão por aproximadamente ~3-5 meses (em nossa experiência). Variando o comprimento e o diâmetro dos filamentos de nitinol, o usuário pode gerar uma ampla gama de pressões que abrangem desde sub-retenção até uma resposta de rolamento quase completa. Em particular, fazer sondas de sub-retenção é mais simples com os filamentos nitinol de menor diâmetro. Usando essas sondas, descobrimos que a pressão, em vez de força, provoca respostas comportamentais não-defensivas mais consistentes4. Demonstramos aqui, usando um modelo de sensibilização nociceptiva induzida por UV bem estabelecidomodelo 7,10,13, que esses filamentos também são uma ferramenta útil para estudar a hipersensibilidade mecânica — a allodynia e a hiperalgesia.
Estudos anteriores utilizando sondas mecânicas fabricadas a partir da linha de pesca levaram a uma certa variabilidade na responsividade comportamental2,6,16,17. Vários fatores podem explicar isso. Primeiro, como a pressão é a variável importante, o polimento da ponta de filamento para que ela seja arredondada e não tenha bordas afiadas é fundamental. Em segundo lugar, relatar valores de pressão em vez de apenas força é importante para a reprodutibilidade dos experimentos, pois diferentes sondas mecânicas que geram forças semelhantes podem provocar pressões díspares4. Em terceiro lugar, é fundamental aplicar apenas uma estimulação mecânica por larva usando sondas nocivas, pois tais sondas produzem um dano tecidual dependente de dose nos níveis epidérmico4 e neuronal sensorial(Figura 2E). Um segundo ou subsequente estímulo mecânico nocivo, após danos teciduais induzidos, poderia, concebivelmente, prejudicar a função dos neurônios sensoriais periféricos afetados e provocar uma resposta comportamental alterada. Em outro estudo, as larvas estimuladas duas vezes com sondas mecânicas nocivas apresentaram principalmente uma resposta comportamental aprimorada5,sugerindo o desenvolvimento de uma sensibilização mecânica aguda (hiperalgesia), que pode resultar do dano tecidual provocado pelo primeiro estímulo mecânico nocivo. Por outro lado, outros autores6 relataram uma resposta comportamental mista (aumentada ou diminuída), indicando que a resposta comportamental alterada pode ser devido a danos/disfunção do tecido neuronal. Estimular cada larva apenas uma vez elimina uma possível variância nas respostas comportamentais resultantes da sensibilização ou dano tecidual. Em quarto lugar, estimulamos mecanicamente o segmento A8, que é mais posterior do que estudos anteriores (áreas preferenciais A3-A4)2,5,16. As sondas entre ~3.900 kPa e 5.300 kPa aplicadas no segmento A2 ou A8 não mostraram diferenças comportamentais4. Além disso, o A8, comparado ao A2-A4, é mais fácil de estimular com sondas mecânicas que geram pressões mais baixas (<300 kPa) porque a larva é mais fina nesta região e, portanto, mais facilmente compactada. Outros estudos mostraram que a estimulação mecânica nociva da extremidade posterior da larva (fornecida por um pino de inseto rígido, mantida com fórceps) evocava principalmente a locomoção para a frente, em vez de uma resposta aversiva ou rolando18. Essa resposta comportamental diferente pode ser devido a diferenças nas propriedades dos materiais usados (filamento nitinol flexível versus pino de inseto incompressível) ou a diferentes pressões entregues às larvas (o valor de pressão do pino de inseto não foi relatado).
O desenvolvimento de um ensaio mecânico de nocicepção para larvas de Drosophila permitiu que o campo descobrisse que diferentes canais de íons sensoriais mecânicos e circuitos neurais mediam a nocicepção mecânica5,6,16,17. No entanto, o estudo da hipersensibilidade mecânica (aodínia e hiperalgesia) tem defasado, comparado à sensibilização das outras modalidades sensoriais — calor7,8,10,13,14, frio9e químico3. Essa defasagem pode ser devido, em parte, à ausência de sondas mecânicas adequadas que podem gerar uma faixa de resposta completa que abrange sublocações a pressões suprathreshold. De particular importância, especialmente para avaliar a alodynia mecânica, são sondas sub-retenção que não provocam uma resposta aversiva de larvas não feridas. O significado de nossas sondas mecânicas melhoradas é que elas podem ser fabricadas para abranger estímulos inócuos (subthreshold ~174 kPa-200 kPa) ou a faixa nociva de baixa a alta (suprathreshold ~225 kPa a ~5.116 kPa). Aqui, demonstramos usando os filamentos nitinol von Frey que as larvas de Drosophila desenvolvem tanto a allodinia mecânica quanto hiperalgesia mecânica após a irradiação UV. A sensibilização mecânica mostra algumas diferenças quando comparadas à sensibilização térmica. Tanto o início quanto o pico de sensibilização mecânica é anterior (~4 h) em comparação com a sensibilização térmica (calor) (~8 h para hiperalgesia e ~24 h para a allodynia)7. Além disso, a aodínia mecânica e a hiperalgesia são concomitantes (ambos com pico de ~4 h). Além disso, enquanto a sensibilização do calor (liga e hiperalgesia) resolve completamente nos pontosposteriores 7, a hipersensibilidade mecânica exibiu uma cauda longa que permaneceu ligeiramente acima da linha de base. A sensibilização a frio em Drosophila envolve uma mudança nos comportamentos evocados a frio9 e o surgimento de novos comportamentos evocados a frio — um fenômeno que não é observado com estimulação mecânica. Essas diferenças de início, duração e comportamentos observados sugerem que cada modalidade sensorial pode ser controlada por diferentes vias de sinalização. A combinação do ensaio de sensibilização aqui descrito com as poderosas ferramentas genéticas disponíveis em Drosophila deve permitir uma dissecção genética precisa da hipersensibilidade mecânica (aodínia e hiperalgesia) observada.

As larvas de drosophila apresentam um comportamento de rolamento aversivo característico quando expostas a diferentes estímulos nocivos: térmico1,mecânico2e químico3. Este comportamento é claramente distinto da locomoção normal. Aqui descrevemos um ensaio mecânico melhorado que pode ser usado para avaliar a nocicepção mecânica e a sensibilização mecânica.
Em um estudo recente, fabricamos filamentos como von Frey usando fios de nitinol4. Sondas exercendo diferentes forças e pressões foram feitas variando os comprimentos e diâmetros dos fios nitinol formando cada sonda. As sondas mecânicas foram calibradas e os valores de força medidos (em mililiton, mN) foram convertidos em pressão (kilopascal, kPa), com base na área de ponta de cada sonda4. A fabricação personalizada de sondas mecânicas nos permitiu gerar subtensidade (≤200 kPa) para as pressões suprathreshold (225 kPa a 5318 kPa), o que poderia, em princípio, ser benéfico para o estudo da hipersensibilidade mecânica. Utilizando esses filamentos mecânicos melhorados como von Frey, mostramos que a pressão4, em oposição à força previamente examinada2,5,6 correlaciona-se de forma mais consistente com a resposta comportamental aversiva nas larvas de Drosophila. O ensaio mecânico melhorado aqui descrito também ajudou a identificar um fator de crescimento endotelial vascular conservado (VEGF) que sinaliza uma via que regula o nociception mecânico em moscas e ratos4.
A hipânia mecânica e a hiperalgesia, duas modalidades de hipersensibilidade, são relativamente subestudadas em larvas de Drosophila, em comparação com as modalidades térmica (calor e frio) e sensorial química3,7,8,9,10. Isso provavelmente se deve à falta de sondas mecânicas específicas que vão desde estímulos inócuos até a alta faixa nociva2,5,6. Um estímulo normalmente inócuo que provoca o típico comportamento de rolagem aversivo após a larva de Drosophila experimentar danos teciduais3,7 é referido como aodínia. Uma resposta exagerada a um estímulo tipicamente nocivo é conhecida como hiperalgesia7. Estímulos nocivos são definidos como aqueles que provocam danos teciduais e podem ativar nociceptores11. Estímulos nocivos entregues às larvas de Drosophila danificam a epiderme da barreira, os neurônios sensoriais nociceptivos periféricos3,4,7ou ambos.
Neste artigo, demonstramos como fabricar e calibrar sondas mecânicas semelhantes a von Frey que são apropriadas para larvas de Drosophila. Além disso, mostramos como usar essas sondas para avaliar respostas nociceptivas mecânicas em larvas de Drosophila. Por fim, demonstramos ainda a utilidade dessas sondas utilizando-as para demonstrar a presença de hipersensibilidade mecânica, tanto a liga quanto a hiperalgesia, após danos teciduais em larvas de Drosophila (ver Resultados Representativos).

<table><tbody><tr><td>Beaker</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-540C</td><td>Beaker of 10 ml of capacity. Any similar container will do.</td></tr><tr><td>Black (Arkansas) bench stone</td><td>Dan&amp;rsquo;s Whetstone</td><td>SKU: I200306B24b-HQ-BAB-622-C</td><td>Used to smoothe any irregularities of the nitinol wire tips. https://www.danswhetstone.com/product/special-extra-wide-black-bench-stone-6-x-2-1-2-x-1-2/</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td>Any equivalent confocal microscope will do</td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-816</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-glass-staining-dishes-10-slides-screw-cap/08816#?keyword=08-816</td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>Fisher Scientific</td><td>E138-500</td><td>For anesthetizing larvae.</td></tr><tr><td>Etherization chamber</td><td></td><td></td><td>This is a homemade customized chamber. Please see details of its construction in our previous published paper12. The purpose of the etherization chamber is allow entry of diethyl ether fumes but prevent larval escape.</td></tr><tr><td>Fiber Optic Light Guide</td><td>Schott AG</td><td>A08575</td><td>Schott Dual Gooseneck 23 inch</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tool</td><td>FS-1670</td><td>For transferring larvae</td></tr><tr><td>Glue</td><td>Aleene&#039;s</td><td>N/A</td><td>Aleene&#039;s&amp;reg; Wood Glue, formerly called (Aleene&#039;s All-Purpose Wood Glue)&lt;br/&gt; https://www.aleenes.com/aleenes-wood-glue</td></tr><tr><td>Graspable holder</td><td>Loew Cornell</td><td>N/A</td><td>Loew-Cornell Simply Art Wood Colored Craft Sticks, 500 pieces.</td></tr><tr><td>Halocarbon oil 700</td><td>Sigma</td><td>H8898-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermic needle 30G 1/2&quot;L</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1471286</td><td>BD Precisionglide&amp;reg; syringe needles, gauge 30, L 1/2 inches. Used to make a hole into the wooden holder for the nitinol wires</td></tr><tr><td>Large Petridish</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td>60 mm x 10 mm Polystyrene Petridish</td></tr><tr><td>Microscope (Zeiss) Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>NT55-605</td><td>Any equivalent microscope will do</td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass 22x22</td><td>Fisher</td><td>12-545-B</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass 22x40</td><td>Corning</td><td>2980-224</td><td>Tickness 1 1/2</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Globe Scientific Inc.</td><td>1358Y</td><td></td></tr><tr><td>Mini Diagonal Cutter</td><td>Fisher Scientific</td><td>S43981</td><td>For cutting nitinol filaments</td></tr><tr><td>Nitinol filaments, Diameters: 0.004&amp;rdquo;, 0.006&amp;rdquo;, 0.008&amp;rdquo;</td><td>Mailin Co</td><td>N/A</td><td>Fifteen pieces of each diameter of 12&amp;rdquo; length were ordered.&lt;br/&gt; https://malinco.com/</td></tr><tr><td>Piece of black vinyl</td><td>Office Depot</td><td>N/A</td><td>We use a small piece of vinyl cut from a binder. Dark color provides contrast. A small piece allows orientation of the larva</td></tr><tr><td>Small Petridish</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td>35 mm x 10 mm Polystyrene Petridish</td></tr><tr><td>Spatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td>Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula. Used to place the food in the petri dish</td></tr><tr><td>Wipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>Kimpes KMTECH, Science Brand. Used to dry larvae of excess moisture.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;W&lt;sup&gt;1118&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>3605</td><td>Control strain for behavioral assays</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;ppk-Gal4&gt;UAS-mCD8-GFP&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>8749</td><td>Strain for fluorescent labeling of class IV md neurons</td></tr></tbody></table>

an improved assay and tools for measuring mechanical nociception in drosophila larvae

Ensaios publicados para nocicepção mecânica em Drosophila levaram a avaliações variáveis de comportamento. Aqui, fabricamos, para uso com larvas de Drosophila, filamentos personalizados de liga de níquel-titânio metálico (nitinol). Estas sondas mecânicas são semelhantes aos filamentos von Frey usados em vertebrados para medir a nocicepção mecânica. Aqui, demonstramos como fazer e calibrar essas sondas mecânicas e como gerar uma dose-resposta comportamental completa de subtenses (alcance inócuo ou não nocivo) para estímulos supraterreshold (de baixo a alto alcance nocivo). Para demonstrar a utilidade das sondas, investigamos hipersensibilidade induzida por danos teciduais em larvas de Drosophila. A hipânia mecânica (hipersensibilidade a um estímulo mecânico normalmente inócuo) e a hiperalgesia (resposta exagerada a um estímulo mecânico nocivo) ainda não foram estabelecidas em larvas de Drosophila. Usando sondas mecânicas que normalmente são inócuas ou sondas que normalmente provocam um comportamento aversivo, descobrimos que as larvas de Drosophila desenvolvem hipersensitização mecânica (tanto a allodynia quanto hiperalgesia) após danos teciduais. Assim, as sondas mecânicas e ensaios que ilustramos aqui provavelmente serão ferramentas importantes para dissecar os mecanismos moleculares/genéticos fundamentais da hipersensibilidade mecânica.

Desenvolvemos sondas mecânicas personalizadas, utilizando filamentos nitinol(Figura 1A,N),para obter comportamentos mecanicamente evocados e geramos uma curva completa de resposta de dose comportamental usando sondas mecânicas inócuas e nociiosas de intensidade variada(Figura 2D) demonstrando que essas sondas podem ser usadas para estudar a linha de base (na ausência de lesão) nocicepção mecânica.
Nossos resultados de ensaio comportamental determinaram que as sondas que exercem pressões abaixo de 200 kPa (~1,57 mN)(Figura 1M), quando aplicadas às larvas de Drosophila, não provocam uma resposta de rolamento aversiva(Figura 2D e Vídeo 3). Como esperado, essas sondas mecânicas subtenindo ou não nocivas (175 kPa ou 200 kPa) não provocaram danos visíveis no tecido neuronal(Figura 2E). Por não induzirem danos, tais sondas podem ser úteis para avaliar a aodínia mecânica (hipersensibilidade a um estímulo mecânico normalmente não nocivo). Por outro lado, testes suprathreshold ou nocivos (de 462 kPa a 5.116 kPa), provocaram uma resposta comportamental aumentada(Figura 2D) de forma dependente de dose — com as pressões mais altas provocando respostas comportamentais mais fortes. Como previsto, a pressão mecânica suprathreshold também induziu danos teciduais dependentes de dose aos próprios neurônios sensoriais periféricos(Figura 2E). A área medida de dano tecidual (em μm2 ± desvio padrão) retirada de quatro larvas para cada grupo foram: 2.051,03 ± 703,81 (462 kPa), 5.102.02.03.03.81 (462 kPa), 5.102.02.29 ± 1.004,67 (2.283 kPa) e 12.238,83 ± 3.724,11 (5.116 kPa). Assim, pressões maiores ou iguais a 462 kPa (~63 mN), que evocam uma resposta de rolamento aversiva (em 25% ou mais das larvas) e causam danos visíveis no tecido neuronal(Figura 2E),poderiam ser apropriadas para estudar hiperalgesia mecânica (hipersensibilidade a estímulos mecânicos normalmente nocivos). Sondas mecânicas nociceptivas (≥462 kPa) sempre induzem danos teciduais (n = 10, avaliados qualitativamente), mas nem sempre provocam uma resposta de rolamento aversiva.
Para avaliar a hipersensibilidade mecânica (aodínia e hiperalgesia), utilizou-se um modelo larval drosophila bem estabelecido de sensibilização nociceptiva que usa irradiação de luz ultravioleta (UV) para induzir danos teciduais7,12. Este ensaio ajudou a dissecar os mecanismos genéticos e celulares da hipersensibilidade nociceptiva térmica8,9,10,13,14,15. Para determinar se o tratamento UV causa a aodínia mecânica, o controle médio da terceira instar(w1118) larvas foram irradiadas simuladas ou irradiadas UV (15-20 mJ/cm2)(Figura 3A). Em seguida, as larvas foram testadas comportamentalmente às 2h, 4h, 8h, 16 h e 24h após o tratamento com uma sonda mecânica normalmente sub-ressarada (200 kPa, 1,57 mN). Aproximadamente 20% das larvas responderam logo às 2h após o tratamento UV, enquanto 50% responderam às 4h, contra 6,6% e 8,3% simularam animais irradiados por UV, respectivamente(Figura 3B). Isso indica que danos teciduais induzidos por UV causam aodínia mecânica a 4h após a irradiação. Em tempos posteriores (8h, 16 h e 24h) a resposta comportamental das larvas tratadas com UV foi na faixa de 16%-20% de respondentes (média de n = 3-6 conjuntos de 10 larvas cada), ligeiramente aumentada (mas não estatisticamente significativa) em comparação com o grupo de controle irradiado simulado (na faixa de 3%-6% dos respondentes, média média de n = 3-6 conjuntos de 10 larvas cada) (Figura 3B).
Para investigar a hiperalgesia mecânica, foi utilizada uma pressão suprathreshold (462 kPa, 3,63 mN), que normalmente induz uma resposta aversiva em ~20% das larvas(Figura 2D) e causa danos no tecido neuronal(Figura 2E). Aplicamos a sonda de 462 kPa no lado dorsal das larvas com ou sem danos teciduais induzidos por UV(Figura 3A). Descobrimos que as larvas sondadas às 4h, 8 h e 16h após o tratamento UV apresentaram um aumento significativo na resposta aversiva, sendo 4h o pico da hipersensibilidade comportamental (~60% responsivo); animais irradiados por UV simulados mostraram ~27% de resposta aversiva(Figura 3C). Semelhante à aodínia mecânica, a resposta comportamental às 8h, 16 h e 24h de animais tratados com UV (na faixa de 36%-42%) foi estatisticamente indistinguível das larvas não tratadas (na faixa de 20%a 26%). Larvas no final do terceiro estágio instar mostraram uma ligeira diminuição da resposta comportamental da linha de base quando comparada com o terceiro estágio instar médio. Nós imaginamos que isso pode ser pelo aumento do tamanho das larvas (Figura 2A) ou pelo aumento da espessura da cutícula que cobre o corpo. Esse fato poderia explicar por que, em um estágio posterior de desenvolvimento, o tratamento UV não induz maior sensibilização mecânica, como observado 4h pós tratamento UV.
Juntos, nossos resultados indicam que as larvas de Drosophila desenvolvem ligas mecânicas e hiperalgesia mecânica após danos teciduais induzidos por UV. O horário de pico da aodínia mecânica e hiperalgesia é o mesmo, 4h após o tratamento UV; no entanto, a hiperalgesia mecânica tem uma cauda temporal mais pronunciada à medida que retorna à linha de base mais lentamente em comparação com a aodínia mecânica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61911/61911fig01.jpg"> Figura 1: Desenvolvimento de uma ferramenta semelhante a Von Frey para avaliar o nocicepção mecânica em larvas de Drosophila. (A) Imagem de uma sonda mecânica usada para estudar nocicepção mecânica em larvas de Drosophila. (B) Filamentos de nitinol e seus diâmetros relativos são mostrados em escala relativa. (C) Imagem do cortador de arame diagonal usado para cortar os filamentos de nitinol. (D) Suavizar as bordas afiadas do filamento nitinol cortado com uma pedra afiada. (E) Agulha hipodérmica usada para fazer um buraco na alça do palito de picolé de madeira da sonda. A ponta da agulha precisa atingir pelo menos metade da altura da vara de alça para inserção segura do filamento. (F-G) Fixação do filamento nitinol colando em uma alça de palito de picolé de madeira com orifício de inserção. (H-L) Calibração de sondas mecânicas pressionando-as contra uma balança. (M) Valores de força (em mN) e pressão (em kPa) gerados por diferentes sondas mecânicas. O comprimento de cada filamento nitinol usado para construir as sondas (P1-P10; P: sonda) é detalhada em centímetros (cm). (N) Uma imagem de um conjunto completo de sondas mecânicas, variando de 174 kPa a 5.116 kPa. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61911/61911fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61911/61911fig02v2.jpg"> Figura 2: Ensaio de nocicepção mecânica: Filamentos semelhantes a Von Frey geram uma curva dose-resposta do comportamento de rolamento aversivo e causam danos teciduais aos neurônios sensoriais. (A) Fotos dos diferentes estágios (segunda e terceira instar) das larvas de Drosophila. Barra de escala: 2 mm. (B) Desenho animado da vista dorsal da terceira larva instar Drosophila. O ponto vermelho indica o segmento abdominal onde a sonda mecânica é aplicada. T: segmento torácico; A: segmento abdominal. Outros marcos anatômicos são rotulados. (C) Desenho animado do ensaio: Uma sonda mecânica é aplicada no lado dorsal da larva até que se dobra contra a superfície abaixo e, em seguida, é mantida por 2 s. Se a pressão for suficientemente alta, isso provoca uma resposta aversiva ao ser liberada. (D) Resposta à dose comportamental; cada ponto azul representa a porcentagem de larvas que responderam, com rolamento aversivo, à estimulação mecânica dentro de um conjunto de 10 animais. Gráfico de violino da porcentagem de comportamento aversivo de rolamento induzido por diferentes sondas mecânicas. kPa: kilopascals. As parcelas da caixa representam medianas (verdes), os bigodes (vermelho) representam os percentis 10 e 90. (E) Danos teciduais: Terceira larva instar (do genótipo ppk-Gal4>UAS-mCD8-GFP para rotular neurônios sensoriais nociceptivos) foram sondadas no segmento dorsal A8 com as pressões indicadas. Os neurônios sensoriais classe IV com a classe IV (através da linha dorsal) foram então examinados (ver seções 4 e 5). As áreas brancas (asteriscos vermelhos) representam lacunas ou danos teciduais. Barra de escala: 100 μm. No painel B, a larva é mostrada na visão dorsal, enquanto em C é a visão lateral. Sondas mecânicas pressionadas contra o lado da cutícula dorsal-epiderme da larva produzem uma depressão semelhante ao bolso no ponto de contato da ponta da sonda e das áreas circundantes. A linha preta sólida curvada em direção ao lado ventral é a parte superior do bolso, enquanto a linha lateral cinza tracejada representa o lado lateral e a parte inferior do bolso. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61911/61911fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61911/61911fig03v2.jpg"> Figura 3: Hipersensibilidade mecânica após dano uv. (A) Esquema do projeto experimental para testar a sensibilização. A instar do terço médio foi tratada simulada (não-UV) ou UV irradiada. O ensaio de nocicepção mecânica foi então realizado em diferentes pontos de tempo (2h, 4h, 8h, 16h e 24h) após tratamento simulado ou irradiação. (B) Alodinia mecânica: A porcentagem de larvas que exibem rolamento aversivo após sondagem com um estímulo mecânico normalmente subtenido ou não nocivo (200 kPa, 1,57 mN) nos pontos de tempo indicados após o mock-treatment ou irradiação UV. (C) Hiperalgesia mecânica: A porcentagem de larvas que apresentam rolamento aversivo após sondagem com um normalmente suprathreshold ou estímulo mecânico nocivo (462 kPa, 3,63 mN) nos pontos de tempo indicados após o mock-treatment ou irradiação UV. As barras de erro indicam que o teste tnão remunerado de duas caudas foi utilizado para análise estatística: *p < 0,05, **p < 0,01; ns: não significativo. Cada ponto vermelho, nos painéis B e C, representa a proporção média de 10 larvas, n = 3-6 conjuntos por ponto/condição. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61911/61911fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Vídeo 1: Locomoção normal de larvas de Drosophila. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61911/Video_1_regresolu.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Vídeo 2: Estimulação mecânica nociva de larvas de Drosophila. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61911/Video_2_regresol.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Vídeo 3: Estimulação mecânica subthreshold de larvas de Drosophila. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61911/Video_3_Subthreshold_short.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>

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An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

O objetivo deste protocolo é mostrar como realizar um ensaio melhorado para o nocicepção mecânica em larvas de Drosophila. Usamos o ensaio aqui para demonstrar que a hipersensibilidade mecânica (aodínia e hiperalgesia) existe em larvas de Drosophila.

Um ensaio e ferramentas aprimoradas para medir o nocicepção mecânico em larvas de Drosophila

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Behavior

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

4.7K visualizações.  The University of Texas MD Anderson Cancer Center. O objetivo deste protocolo é mostrar como realizar um ensaio melhorado para o nocicepção mecânica em larvas de Drosophila. Usamos o ensaio aqui para demonstrar que a hipersensibilidade mecânica (aodínia e hiperalgesia) existe em larvas de Drosophila.

Vídeo: An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

De alta resolução de Medição do Comportamento Odor-Driven em larvas de Drosophila

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Biologia

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

O uso de chips microfluídicos para Imagens ao vivo e estudo das respostas Lesão em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Bioengenharia

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

Métodos locais e globais de Avaliação nocicepção térmica em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Neurociência

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an intricate network of inducers, detectors, and activators rapidly responds to neuron damage, infection or other immune infractions. This inflammation of immune cells is intimately associated with the pathology of neurodegenerative disorders, such as Parkinson&#39;s disease (PD), Alzheimer&#39;s disease and ALS. Under compromised disease states, chronic inflammation, intended to minimize neuron damage, may lead to an over-excitation of the immune cells, ultimately resulting in the exacerbation of disease progression. For example, loss of dopaminergic neurons in the midbrain, a hallmark of PD, is accelerated by the excessive activation of the inflammatory response. Though the cause of PD is largely unknown, exposure to environmental toxins has been implicated in the onset of sporadic cases. The herbicide paraquat, for example, has been shown to induce Parkinsonian-like pathology in several animal models, including Drosophila melanogaster. Here, we have used the conserved innate immune response in Drosophila to develop an assay capable of detecting varying levels of nitric oxide, a cell-signaling molecule critical to the activation of the inflammatory response cascade and targeted neuron death. Using paraquat-induced neuronal damage, we assess the impact of these immune insults on neuroinflammatory stimulation through the use of a novel, quantitative assay. Whole brains are fully extracted from flies either exposed to neurotoxins or of genotypes that elevate susceptibility to neurodegeneration then incubated in cell-culture media. Then, using the principles of the Griess reagent reaction, we are able to detect minor changes in the secretion of nitric oxide into cell-culture media, essentially creating a primary live-tissue model in a simple procedure. The utility of this model is amplified by the robust genetic and molecular complexity of Drosophila melanogaster, and this assay can be modified to be applicable to other Drosophila tissues or even other small, whole-organism inflammation models.

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Levels of the inflammatory cell-signaling molecule nitric oxide (NO) are commonly assayed using Griess reagent. In this protocol, we have created a modified Griess assay utilizing live Drosophila brain tissue in order to detect the secretion of NO in a simple, quantifiable and highly repeatable method.

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Imunologia e Infecção

Measuring Changes in Tactile Sensitivity in the Hind Paw of Mice Using an Electronic von Frey Apparatus

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain perception in rodents. Withdrawal thresholds can be measured first at baseline and then following drug, venom, injury, allergen,&#160;or otherwise evoked inflammation by applying an accurate force on very specific areas of the skin. An electronic von Frey apparatus allows precise assessment of mouse hind paw withdrawal thresholds that are not limited by the available filament sizes in contrast to classical von Frey measurements. The ease and rapidity of measurements allow for incorporation of assessment of tactile sensitivity outcomes in diverse models of rapid-onset inflammatory and neuropathic pain as multiple measurements can be taken within a short time period. Experimental measurements for individual rodent subjects can be internally controlled against individual baseline responses and exclusion criteria easily established to standardize baseline responses within and across experimental groups. Thus, measurements using an electronic von Frey apparatus represent a useful modification of the well-established classical von Frey filament-based assays for rodent mechanical allodynia that may also be applied to other nonhuman mammalian models.

Electronic von Frey measurements are an effective and improved alternative to classical von Frey filaments, as they allow rapid and precise measurement of changes in rodent mechanical withdrawal thresholds to continuously applied pressure stimuli before and after an inflammatory event.

Medindo Mudanças na Tátil sensibilidade na pata traseira de ratos utilizando um aparelho eletrônico von Frey

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

Clones em um ensaio comportamental para Mechanosensation de MarcM baseada em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in communication with the epidermal cells they innervate and thus their analysis benefits from in situ visualization of both neuronally and epidermally expressed proteins by immunofluorescence. Traditional methods of preparing larval fillets for immunofluorescence experiments leave intact the muscle tissue that covers most of the body wall, presenting several challenges to imaging neuronal and epidermal proteins. Here we describe a method for removing muscle tissue from Drosophila larval fillets. This protocol enables imaging of proteins that are otherwise obscured by muscle tissue, improves signal to noise ratio, and facilitates the use of super-resolution microscopy to study da neuron development.

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studies of neuronal morphogenesis using Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons benefit from in situ visualization of neuronal and epidermal proteins by immunofluorescence. We describe a procedure that improves immunofluorescence analysis of da neurons and surrounding epidermal cells by removing muscle tissue from the larval body wall.

Remoção de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecido muscular larval Filetes para Análise de imunofluorescência de neurônios sensoriais e células epidérmicas

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Romance Ensaio para Fria nocicepção em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal degeneration are remarkably similar in humans and invertebrates as are the molecular mechanisms that drive these processes. The fruit fly, Drosophila melanogaster, provides a powerful yet simple genetic model organism to study the cellular complexities of neurodegenerative diseases. In fact, approximately 70% of disease-associated human genes have a Drosophila homolog and a plethora of tools and assays have been described using flies to study human neurodegenerative diseases. More specifically the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila has proven to be an effective system to study neuromuscular diseases because of the ability to analyze the structural connections between the neuron and the muscle. Here, we report on an in vivo motor neuron injury assay in Drosophila, which reproducibly induces neurodegeneration at the NMJ by 24 h. Using this methodology, we have described a temporal sequence of cellular events resulting in motor neuron degeneration. The injury method has diverse applications and has also been utilized to identify specific genes required for neurodegeneration and to dissect transcriptional responses to neuronal injury.

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Here we describe a simple and widely accessible method to injure segmental nerves in Drosophila larvae to visualize and quantify neurodegeneration of motor neurons at the neuromuscular junction (NMJ) of third instar larvae.

Uma Metodologia de Lesão Mecânica Neuronal Simples para Estudar<em&gt; Drosophila</em&gt; Degeneração do Neurônio do Motor

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

Local Heat Probe Assay: A Method to Assess Nociception of High Temperatures in Drosophila Larvae

Source: Chattopadhyay, A., et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/3837/" target="_blank">Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae</a>. J. Vis. Exp. (2012).
Drosophila larvae have dedicated sensory neurons&#8211;nociceptors&#8211;whose response to potentially harmful thermal stimuli triggers aversive&#8211;or so-called &#34;nocifensive&#34;&#8211;behaviors in the animal. This video describes a method to assess thermal nociception by recording larval behavior in response to local application of a heat probe onto the cuticle. This method is, therefore, called the local heat probe assay.

Ensaio de sonda de calor local: um método para avaliar a nocicepção de altas temperaturas em larvas de Drosophila

Source: Chattopadhyay, A., et al. Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (2012).
Drosophila larvae ...

Um ensaio e ferramentas aprimoradas para medir o nocicepção mecânico em larvas de Drosophila

Resumo

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Capítulos neste vídeo

De alta resolução de Medição do Comportamento Odor-Driven em larvas de Drosophila

O uso de chips microfluídicos para Imagens ao vivo e estudo das respostas Lesão em

Métodos locais e globais de Avaliação nocicepção térmica em

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Medindo Mudanças na Tátil sensibilidade na pata traseira de ratos utilizando um aparelho eletrônico von Frey

Clones em um ensaio comportamental para Mechanosensation de MarcM baseada em

Remoção de

Romance Ensaio para Fria nocicepção em

Uma Metodologia de Lesão Mecânica Neuronal Simples para Estudar

Ensaio de sonda de calor local: um método para avaliar a nocicepção de altas temperaturas em larvas de Drosophila