O método facilita a medição da confirmação de proteínas e interações proteicas. A composição do buffer, a pureza da amostra e os requisitos de concentração de proteínas são flexíveis, permitindo que o método resolva problemas estruturais desafiadores. Esta técnica permite uma compressão de amostras em uma grande variedade de diferentes sistemas tampão.
Usando nosso método de dosimetria, os pesquisadores podem monitorar o quão bem suas reações de rotulagem estão funcionando em tempo real. Uma aplicação dessa tecnologia está no desenvolvimento de medicamentos porque permite aos pesquisadores testar formulações de medicamentos amplamente diferentes e como elas afetam a estrutura proteica. Para preparar o banco óptico FPOP.
Primeiro ligue o laser e coloque o laser no gatilho externo, energia constante e sem substituição de gás. Quando o laser tiver aquecido, ajuste a energia do laser por pulso entre 80 a 120 miligramas por pulso e use uma tocha de butano para queimar suavemente a codificação de poliimida do capilar no local em que o dosímetro inline lerá o sinal absorvente a 265 nanômetros após a exposição ao laser. Use um lenço sem fiapos e metanol para limpar suavemente os detritos do capilar e colocar o capilar limpo através do caminho do feixe do laser e no dosímetro inline.
Pressione a alavanca na parte superior do dosímetro da linha para abrir a dobradiça e remova os suportes magnéticos. Coloque o capilar no sulco da máquina do dosímetro inline usando os suportes magnéticos para manter o capilar no lugar e feche a dobradiça dosímetro sobre a dobradiça capilar pressionando a dobradiça até que a alavanca se esvaie no lugar. Clique no botão flash iniciar no software de dosimetria para começar a disparar o laser excimer e definir a taxa de repetição predefinida entre 10 a 20 Hertz no software de dosimetria com o disparo a laser mover o estágio motorizado através de sua amplitude de movimento, garantindo que o feixe permaneça centrado na abertura e que a silhueta do capilar possa ser observada por toda parte.
Em seguida, lave o capilar com água a 20 microliters por minuto por minuto e clique em dados de partida mais automático zero no software dosímetro para zerar o dosímetro na água antes de iniciar a coleta de dados. Para realizar um experimento FPOP adicione dois microliters de peróxido de hidrogênio a 18 microliters de solução FPOP e use uma pipeta para misturar suavemente a solução rapidamente coletar a solução na parte inferior do tubo por centrifugação e usar imediatamente uma seringa apertada a gás para carregar a solução em uma bomba de seringa. Clique na bomba inicial e inicie os dados no software dosímetro para iniciar o fluxo na bomba de seringa na taxa de fluxo apropriada e use o dosímetro inline para monitorar a leitura de adenina em tempo real até que o sinal absorvente em 265 nanômetros estabilize a coleta da amostra em um recipiente de resíduos.
Para começar a disparar o laser na taxa de repetição predefinida, clique no botão flash iniciar no software dosímetro e use o dosímetro inline para monitorar a leitura de adenina em tempo real. A diferença na absorção em 265 nanômetros com o laser desligado e o laser ligado serão os absorventes delta a 265 nanômetros de leitura. Para garantir que radicais hidroxil comparáveis estejam disponíveis para reagir com proteínas em diferentes amostras.
Compare os absorventes delta em 265 nanômetros de leitura obtidos com o dosímetro inline com os absorventes delta desejo em 265 nanômetros de leitura obtida de experimentos ou controles anteriores. Se a leitura estiver no nível desejado, colete a amostra imediatamente após o laser ou radiação no tampão de saciar. Para compensar a dose radical eficaz para equalizar as leituras de absorvência alteram a concentração de peróxido de hidrogênio, alteram a energia do laser por pulso ou alteram o plano focal da lente focal para aumentar a fluência do laser.
Para fazer uma mudança de unidade de absorção maior que 10 militos nos absorventes delta lendo refaz a amostra com mais ou menos peróxido de hidrogênio e reprisar a amostra como demonstrado. Para fazer uma pequena mudança na leitura de absorvância em tempo real, use o estágio motorizado de 50 milímetros para ajustar a posição da lente focal para ajustar o plano focal do feixe incidente. Para medir a quantidade efetiva de radical hidroxila presente na amostra após o monitoramento da radiação laser os absorventes delta de adenina a 265 nanômetros em tempo real com um detector capilar UV inline usando o estágio motorizado para ajustar a posição da lente até que os absorventes delta em 265 nanômetros de leitura seja igual à leitura desejada.
A comparação da pegada de peptídeo de cadeia pesada do biossimilar adilumumabe no tampão fosfato e após o aquecimento a 55 graus Celsius por uma hora revela que as regiões de peptídeo indicadas demonstram proteção significativa dos solventes quando a proteína é aquecida para formar agregados. O uso de um dosímetro inline em tempo real para monitorar a diferença nos absorventes de adenina antes e depois do laser ou radiação indica que uma mudança comparável no nível de absorventes de adenina é observada no buffer mes em comparação com o tampão de fosfato. Enquanto a oxidação média dos peptídeos é menor na presença de tampão MES em comparação com o tampão fosfato.
No entanto, à medida que a fluência a laser é aumentada para ter uma resposta de dosimetria de adenina igual, os valores médios de oxidação do peptídeo são quase os mesmos após o tampão e tampão de fosfato FPOP e MES. Como a leitura da dosimetria é afetada pela concentração de peróxido de fluência laser, bem como o carniceiro radical. Tome cuidado para que a resposta da dosimetria entre a pesquisa amostral próxima uma da outra.
Mutagênese dirigida ao site é frequentemente usada para sondar locais protegidos no FPOP. Isso permite que os pesquisadores determinem se as mudanças são devidas a Alistair. Esta técnica facilita a comparação de proteínas em diferentes buffers ou formulações, permitindo que os pesquisadores determinem o efeito de diferentes aditivos na confirmação da proteína.
