Este protocolo mostrará como manchar microglia, realizar análises quantitativas de densidade e morfologia, bem como quantificar a infiltração de macrófagos no cérebro. Esta técnica permite ao pesquisador medir mudanças na distribuição e morfologia de microglia de forma quantitativa e diferenciar microglia de macrófagos infiltrados Este protocolo de análise pode ser facilmente aplicado a outros modelos animais para medir mudanças na distribuição e morfologia microglial onde anticorpos anti-IBA1 e anti-TMEM119 estão disponíveis. É altamente recomendável realizar a contagem celular e traços cegos à condição experimental e ser consistente na forma como este procedimento é realizado.
Para iniciar este procedimento, abra um programa de processamento de imagens como Fiji ou ImageJ que tenha o plug-in de distância do vizinho mais próximo instalado. Abra a imagem 20X se a escala estiver contida nos metadados do arquivo e não definir automaticamente a partir dos metadados. Na barra de menu, selecione Analisar, Definir escala e digite as informações corretas.
Para definir a escala manualmente com base em uma escala impressa na imagem, selecione a ferramenta Linha Reta. Coloque o cursor na borda da escala e pressionando a tecla Shift, desenhe uma linha o mais perto possível da escala na imagem. Selecione Analisar, definir escala.
Uma janela aparecerá e colocará a distância e a unidade de comprimento corretas conhecidas para determinar a unidade por comprimento do pixel e clicar em OK. Em seguida, selecione Imagem, Cor, Faça Composto para criar uma imagem composta de todos os canais. Na barra de menu, selecione Analisar, Definir Medidas. Área de Verificação, Centroid e Perímetro.
No menu Redirecionar Para dropdown, selecione o arquivo Abrir e clique em OK. Vá para Imagem, Cor, Ferramenta de Canal para abrir a ferramenta Canal. Use a ferramenta Seleção à Mão Livre para desenhar um perímetro áspero em torno da região de interesse. Clique duas vezes na ferramenta Oval na barra de ferramentas para habilitar a ferramenta 'Pincel de seleção'.
Certifique-se de que a caixa 'Habilitar pincel' está verificada e clique em OK. Usando o pincel de seleção, ajuste o perímetro para melhor se encaixar na região de interesse, em seguida, pressione T no teclado por toda esta área para seta Y manager. Selecione Analisar, Medir ou Pressionar a tecla M e a janela Resultados aparecerá. Copie e cole os resultados em uma folha de dados e salve as informações sobre a área.
Depois de copiar a área da região de interesse, você baseia as informações da janela Resultados clicando nela e pressionando a tecla Backspace. Selecione a janela ROI Manager, selecione o ROI Trace e altere o nome para corresponder ao nome da imagem pressionando Rename. Clique em OK e clique com o botão direito do mouse no novo nome do ROI Trace e salve.
Clique duas vezes na ferramenta Pincel na barra de ferramentas. Selecione a cor preta e o tamanho do pincel de 10. Certifique-se de que a opção Pintura na sobreposição não está controlada.
No canal TMEM119, coloque cuidadosamente um ponto preto no centro da soma para cada microglia positiva TMEM119. Coloque um ponto branco no centro das células que não são positivas para TMEM119. Repita o mesmo procedimento para todas as células contidas na região de interesse.
Em seguida, selecione Imagem, Cor, Canal Dividido, uma janela para cada canal será exibida. Identifique o canal que tem anotações de ponto e feche as outras duas janelas. Para redirecionar a nova imagem do canal dividido, vá para Analisar, definir medidas.
No menu Redirecionar Para soltar, selecione a Imagem do Canal Dividido e clique em OK. Em seguida, selecione Imagem, Tipo, oito bits. Vá para Ajustar a imagem e selecione Limiar. Ajuste os controles deslizantes até a esquerda em ambas as barras.
Isso deixará apenas os pontos pretos que agora vão parecer brancos. Selecione a região de interesse na janela ROI Manager. Na barra Menu, selecione Analisar, Analisar partículas.
Na caixa de texto para Tamanho, entrada de um a 20. A caixa para unidades Pixel deve permanecer desmarcada enquanto a caixa que é para os resultados de Exibição, Resumo e Adicionar ao Gerente deve ser verificada. Clique em OK para exibir a janela Resumo que dará o número de pontos.
Copie e cole essas informações na ficha técnica. Em seguida, selecione plug-ins NND para mostrar a janela NND. Cada número representa a distância que cada microglia tem à microglia vizinha mais próxima.
Copie e cole todas essas informações na ficha técnica. Volte para a janela Limiar e ajuste o controle deslizante superior todo o caminho para a direita, o que deixará todos os pontos brancos visíveis, agora aparecendo branco. Selecione Analisar, analisar partículas para exibir a janela Analisar partículas.
Clique em OK para mostrar a janela Resumo que fornece o número de pontos. Copie e cole essas informações na ficha técnica. Vá até o GERENCIADOr de ROI e selecione todos os pontos.
Em seguida, clique com o botão direito do mouse e Salve com o nome da imagem. Isso permitirá a salvação de todos os pontos em um arquivo ZIP. Primeiro, abra os arquivos de imagem 4DX.
Uma janela pop-up aparecerá perguntando se as imagens devem ser abertas em uma pilha. Clique em OK. Em seguida, selecione Imagem, Pilhas, ZProject para abrir a janela de Projeção Z. Inclua todas as fatias da primeira até a última fatia.
Certifique-se de que a Intensidade Máxima está selecionada em Tipo de Projeção e clique em OK. Clique na nova janela que contém o ZProject. Selecione Imagem, Cores, Canais Divididos e realize os traços nas imagens do canal IBA1. Na barra Menu, selecione Analisar, Definir Medidas.
Verifique a Área, Centroid e Perímetro. No menu Redirecionar Para soltar, selecione o arquivo aberto e clique em OK. Para definir a escala manualmente com base em uma escala impressa na imagem, selecione a ferramenta Linha Reta. Coloque o cursor na borda da escala e pressionando a tecla Shift, desenhe uma linha o mais perto possível da escala na imagem.
Selecione Analisar, definir escala. Uma janela vai aparecer. Insira a distância e a unidade de comprimento conhecidas corretas para determinar os Pixels por unidade de comprimento e clique em OK. Para medir o tamanho da soma no canal IBA1, desenhe um perímetro áspero da soma com a ferramenta Seleção à Mão Livre.
Clique duas vezes na ferramenta Oval na barra de ferramentas para habilitar a ferramenta Pincel de Seleção. Certifique-se de que a caixa 'Habilitar pincel' está verificada e clique em OK. Usando o pincel de seleção, ajuste o traço para melhor se encaixar na soma. O zoom permitirá a precisão durante esta etapa.
Em seguida, pressione a tecla T para adicionar o traço soma ao ROI Manager. Selecione Analisar, Medir ou pressione a tecla M para exibir os resultados. Copie e cole esses resultados em uma folha de dados.
Vá para a janela ROI Manager, selecione a região de interesse e altere o nome para corresponder ao nome da imagem pressionando Rename. Clique com o botão direito do mouse na região renomeada de interesse e clique em Salvar. Certifique-se de que o nome especifica que o rastreamento é para soma e salvar o arquivo.
Para medir a área de arborização no canal IBA1, selecione primeiro a ferramenta Seleção de Polígono. Clique na extremidade do processo microglial com a ferramenta para iniciar a forma do polígono. Vá ao redor da microglia clicando nas pontas de cada extremidade do processo para formar um polígono que melhor representa a área coberta pelas arborizações microgliais.
Quando o polígono estiver completo, clique no ponto de partida para fechá-lo. Em seguida, pressione a tecla T para adicionar o rastreamento ao ROI Manager. Selecione Analisar, Medir ou pressione a tecla M para adicionar os dados à janela Resultados.
Copie e cole esses dados na ficha técnica. Para salvar as informações relativas à área de arborização, acesse a janela ROI Manager, selecione a região de interesse e altere o nome para corresponder ao nome da imagem pressionando Rename. Clique com o botão direito do mouse na região renomeada de interesse e clique em Salvar.
Certifique-se de que o nome especifica que o rastreamento é para arborização e salve o arquivo. Este estudo descreveu o fluxo de trabalho passo a passo para a co-coloração imunofluorescente de IBA1 e TMEM119 e para a análise da densidade microglial, distribuição e morfologia, bem como de infiltração de células mieloides periféricas no tecido cerebral do camundongo. A microscopia de fluorescência é usada para imagem da co-rotulagem de microglia usando IBA1 e TMEM119 na seção coronal do hipocampo dorsal na ampliação de 20X.
Uma coloração bem sucedida revela corpos de células microgliais e seus belos processos. A coloração permite a determinação da densidade e distribuição de microgliais e para a identificação de aglomerados microgliais e macrófagos infiltrados. A microscopia confocal é usada para imaginar o procedimento de rastreamento de arborização microglial stepwise na ampliação de 40X.
Esses resultados representativos mostram a microglia positiva IBA1 e TMEM119, bem como um exemplo de rastreamento corporal celular. É importante ser consistente na contagem de células e prestar atenção aos dois sinais de IBA1 e TMEM119. Essa técnica permite ao pesquisador identificar regiões do cérebro afetadas por um estímulo particular que pode então ser estudado mais aprofundado com técnicas complementares.
