Bactérias intracelulares secretam proteínas efeitos no hospedeiro que podem manipular caminhos biológicos para promover a sobrevivência do patógeno. Revelar alvos hospedeiros de efeitos é essencial para entender patógenos intracelulares como clamídia trachomatis. A toxicidade da levedura e as telas supressoras podem fornecer informações fundamentais sobre o alvo biológico natural das proteínas de efeitos bacterianos e podem ser particularmente úteis quando um parceiro de ligação é desconhecido.
Demonstramos a toxicidade da levedura e os ensaios supressores aqui para triagem de proteínas efeitos de clamídia trachomatis, mas esta técnica também tem sido usada para caracterizar os efeitos Legionella pneumophila e Coxiella burnetii. Comece inoculando cinco mililitros de caldo único com a única colônia de levedura transformada com a proteína do efeito contendo plasmídeo. Use a levedura transformada apenas com o vetor como um controle negativo e incubar o inóculo durante a noite a 30 graus Celsius enquanto treme.
No dia seguinte, adicione 180 microliters de água estéril aos poços A2 através de A6 de uma placa de 96 poços. Vórtice a cultura da noite para o dia e adicionar 180 microliters de levedura ao bem A1. Em seguida, diluir o fermento nos poços com água. Use uma pipeta multicanal para detectar cinco microliters de cada diluição em glicose de gota única e placas de ágar de gota única e incubar as placas a 30 graus Celsius por 48 horas.
Após a incubação, avalie visualmente a toxicidade comparando o crescimento da levedura expressando a proteína effectora cultivada na mídia que contém galactose ao crescimento da levedura expressando apenas o vetor. Inocular 100 mililitros do caldo único com um mililitro do estoque de levedura previamente preparado e incuba-lo por 16 a 24 horas a 30 graus Celsius com agitação a 150 RPM. No dia seguinte, adicione os 100 mililitros da cultura da noite para o dia a 900 mililitros de caldo de gota único pré-aquecido e incubar o frasco por quatro a cinco horas a 30 graus Celsius enquanto treme.
Após a incubação, pelota a cultura a 6.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 250 mililitros de água estéril. Repita a centrifugação e descarte o supernatante.
Em seguida, resuspend a pelota em 250 mililitros de um acetato de lítio milimiliar. Pelota a cultura por centrifugação, remova o acetato de lítio e resuspenja a pelota em 9,6 mililitros de 50%PEG 3350. Em seguida, adicione reagentes de transformação como descrito no manuscrito e ajuste o volume para 15 mililitros com água estéril invertendo suavemente para misturar.
Incubar a mistura a 30 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, adicione 750 microliters de DMSO e incubar em um banho de água a 42 graus Celsius por mais 30 minutos. Adicionar o DMSO antes do choque térmico é crucial para alcançar uma alta eficiência de transformação.
Após a incubação, pelota a levedura por centrifugação a 3.000 vezes g por cinco minutos. Descarte o supernatante e lave a pelota com 10 mililitros de água estéril e depois repita a centrifugação para pelotar o fermento. Resuspend a pelota em oito mililitros de água.
Determine a eficiência de transformação diluindo a amostra de um a 10 e emplacando 100 microliters de cada diluição em ágar duplo. Em seguida, a placa 200 microliters da amostra em placas de ágar de gota dupla e incubar as placas a 30 graus Celsius por 48 a 96 horas ou até que as colônias apareçam. Uma vez que as colônias apareceram, remendá-las em ágar galactose dupla e incuba-los por mais 24 a 48 horas.
Use parte do patch para inocular cinco mililitros de caldo duplo e incubar o inóculo durante a noite a 26 graus Celsius com agitação a 150 RPM. No dia seguinte, adicione 180 microliters de água estéril a cinco poços de uma placa de 96 poços começando com bem A2. Vórtice a mistura de cultura da noite para o dia. Adicione 180 microliters de levedura ao poço A1 e dilui-o em série usando a água nos poços A2 a A6. Detectar cinco microlitros de cada diluição em glicose de gota única e placas de ágar de gota única, certificando-se de incluir o efeito tóxico sozinho como controle.
Incubar as placas a 30 graus Celsius por 48 horas e comparar o crescimento da levedura com efeito tóxico sozinho com o crescimento da levedura com o supressor potencial. Para confirmar supressores que demonstraram menor toxicidade em comparação apenas com o efeito tóxico, isole o plasmídeo de acordo com as instruções do manuscrito e transforme-o na levedura tóxica. Inoculado caldo de glicose duplo com uma colônia da placa de transformação.
Incuba-o durante a noite e localiza em glicose dupla e ágar galactose para confirmar a supressão da toxicidade. Antes de realizar a tela supressora de levedura, as proteínas de interesse do efeito foram testadas para toxicidade na levedura. A proteína de interesse foi expressa na levedura sob o controle de um promotor indutível galactose e o crescimento da galactose foi comparado ao crescimento da glicose.
Quando o CT229 foi testado para toxicidade, foram observadas colônias menores e supressão de crescimento. O ideal é que uma diminuição de dois a três logs seja observada para prosseguir com as telas supressoras de levedura. A tela do supressor foi conduzida transformando a cepa tóxica com a biblioteca genômica de levedura pYAP 13 e emplacando os transformadores no ágar galactose.
Os clones supressores obtidos foram vistos em ágar de dupla desistência para confirmar a supressão da toxicidade. Supressores pSup1 e pSup2 suprimiram a toxicidade da proteína effectora, enquanto pSup3 não. Esses procedimentos requerem atenção cuidadosa aos detalhes, além de trabalhos preparatórios críticos, incluindo ter grandes quantidades de mídia e placas prontas antes de realizar o experimento.
Uma vez identificados os supressores, experimentos podem ser realizados para verificar interações com o efeito de interesse, incluindo pull downs, imunofluorescence colocalization, effector knockout ou knockdown de fatores hospedeiros identificados nas telas. O desenvolvimento desta técnica para os efeitos da Clamídia permitiu a caracterização preliminar acelerada de proteínas efeitosoras e ajudou a concentrar nossos esforços na elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes que mediam as interações de patógenos hospedeiros.
