Este protocolo utiliza uma técnica amplamente utilizada, juntamente com reagentes e ferramentas que podem ser adquiridas comercialmente para avaliar a ativação endógena do IRF5 durante os primeiros eventos de estimulação. Pode ser facilmente aplicado para sondar a biologia IRF5 em outro contexto celular. Embora o PAGE nativo seja uma técnica amplamente utilizada, obter resultados claros, robustos, interpretatáveis e reprodutíveis pode ser tecnicamente desafiador.
O uso de um sistema comercial de buffer e gel ajuda a minimizar a variabilidade. E prestar atenção aos detalhes é essencial, e a experiência é a chave para o sucesso na obtenção de bons resultados. Este protocolo page nativo modificado envolve muitas etapas com detalhes sutis que são fundamentais para o sucesso.
A demonstração visual pode mostrar esses detalhes que seriam benéficos para os pesquisadores. Mantenha a cultura celular CAL-1 em um frasco T75 a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, com meio RPMI completo 1640. Quando estiver pronto para estimular as células, transfira-as para um tubo cônico de 50 mililitros e centrífugas a 200 x g por cinco minutos.
Remova o supernatante e suspenda a pelota em média para obter uma suspensão celular única homogênea. Em seguida, contatabiliza as células com um hemótmetro, e as semeia a uma densidade de 1.000.000 células por poço em uma placa de seis poços com quatro mililitros de meio pré-aquecido em cada poço. Incubar as células por 20 a 24 horas para permitir que a confluência atinja 90 a 95% No dia seguinte, estimule as células adicionando quatro microliters de um miligrama por mililitro R848 por poço, certificando-se de deixar um controle bem com as células e sem tratamento R848.
Balance suavemente a placa de um lado para o outro para dispersar uniformemente o R848, em seguida, incubar as células por 2 a 16 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, transfira as suspensões celulares da placa para tubos de centrífugas de 5 mililitros. Centrifugar as células a 200 x g por cinco minutos, depois remova o supernasce e suspenda novamente a pelota em um mililitro de PBS.
Transfira a suspensão celular para um tubo de 1,5 mililitro, e gire-a a 12.000 x g por 30 a 60 segundos a 4 graus Celsius, depois remova cuidadosamente o supernasce. Prepare o tampão de lise de acordo com as instruções do manuscrito, e mantenha-o no gelo até estar pronto para uso. Suspenda a pelota celular em 30 microliters de tampão de lise gelada, e pipeta para cima e para baixo para misturar.
Em seguida, incubar o tubo no gelo por 15 a 20 minutos. Esclareça o lise por centrifugação a 12.000 x g por 15 a 20 minutos a 4 graus Celsius, e transfira o supernasce para um tubo pré-refrigerado de 1,5 mililitro, certificando-se de manter os extratos no gelo o tempo todo. Em seguida, meça a concentração de proteínas usando Bradford Reagent.
Prepare os buffers de eletroforese de câmara superior e inferior de acordo com as instruções do manuscrito e enxágue um gel PAGE nativo de 3-12% com água, sem distorcer os poços O cuidado extra deve ser tomado ao manusear o desoxicolato de sódio. Epi para proteção como jaleco, óculos de segurança e máscara são necessários para manusear o produto químico. Em seguida, coloque o gel no Mini Gel Tank, remova o pente, adicione os buffers de eletroforese de câmara superior e inferior preparados e pré-execute-o em uma sala fria de 4 graus Celsius ou no gelo a 150 volts por 30 minutos.
Enquanto isso, prepare as amostras para o carregamento misturando as proteínas celulares no gelo com o Buffer de Amostra Nativa 4X. Uma vez que o pré-funcionamento esteja completo, carregue de 10 a 15 microgramas de proteína para cada poço, e execute o gel por 30 minutos a 85 volts, seguido por duas horas a 150 volts. Em seguida, mergulhe o gel em SDS correndo tampão por 30 minutos em temperatura ambiente.
Ative a membrana de difluoreto de polivinidae, encharcando-a em metanol por aproximadamente cinco minutos. Faça um corte em um canto da membrana para indicar sua orientação, e monte o sanduíche de transferência de acordo com o protocolo do fabricante. Coloque o de transferência no tanque e transfira a 20 volts por uma hora no gelo.
Em seguida, remova a membrana do com fórceps plásticos e bloqueie a membrana no bloqueio do tampão à temperatura ambiente por 45 minutos em um agitador de balanço. Em seguida, incubar a membrana com o anticorpo primário a 4 graus Celsius durante a noite ou à temperatura ambiente por duas horas e lavá-la com tampão de lavagem 1XTBST por três minutos enquanto balança. Em seguida, incubar a membrana com o anticorpo secundário novamente usando o tampão de lavagem 1XTBST à temperatura ambiente por 45 minutos, repetindo as lavagens.
Em seguida, escaneie a mancha usando um sistema de documentação de gel apropriado. Utilizando este protocolo, foram analisadas células CAL-1 estimuladas ou não com R848 com um imunoblot. Em células CAL-1 não estimuladas, o IRF5 foi detectado como uma única banda na PÁGINA nativa correspondente à sua forma monomérica.
Para as células estimuladas, o nível de monômero IRF5 diminuiu, enquanto o nível do escudeiro aumentou. Um imunoblot com anticorpo anti-IRF5 foi realizado em células IRF5 super-expressas 293 T transfectadas com várias construções. Nenhum IRF5 foi detectado no controle não transtrafetado, demonstrando a especificidade do anticorpo anti-IRF5.
Uma única banda correspondente ao IRF5 monomérico só foi detectada nas células 293 T que expressam demais o IRF5. Quando construções codificando proteínas ativantes IRF5 foram co-transfeinadas, uma banda lentamente migratória correspondente à forma dimeric de IRF5 apareceu. No entanto, o NMDA5, uma proteína relacionada ao RIG-I, não induziu a dimerização IRF5.
O uso de géis gradientes Bis-Tris é crucial, provavelmente devido ao pH específico e à composição química deste sistema eletroforético de gel que permitiu a separação de formas monoméricas e dimeric de IRF5. Além disso, a lise e a preservação de lises celulares em tampão de amostra nativa não desnaturação retém estruturas proteicas nativas. Aqui usamos um comercialmente disponível que é adaptado para ácidos PAGE nativos.
Um método adicional que complementa muito com isso é utilizar o sistema de citometria de fluxo de imagem ImageStream para avaliar a translocação nuclear IRF5, que é a substância que na ativação do IRF5 após a dimerização. Quando combinado com nosso protocolo, ele serve como um outro tipo de teste para validar as etapas envolvidas na ativação do IRF5. Sendo um dos principais reguladores da resposta inflamatória, o IRF5 desempenha um papel importante na infecção e imunidade, doenças autoimunes, câncer e muitas outras doenças importantes para a saúde humana.
Há também esforços no desenvolvimento de terapêuticas para atingir o IRF5 e fatores relacionados à transcrição. Este protocolo permitirá que pesquisadores de diversas áreas compreendam e testem a biologia IRF5.
