Os métodos aqui apresentados permitem a quantificação de lesões de DNA induzidas pelo estresse oxidativo, contribuindo para a compreensão de mecanismos fisiofisiológicos que possam ser alvo de prevenção e tratamento de doenças. Seletividade e sensibilidade são as principais vantagens. A seletividade é uma vantagem essencial ao trabalhar com amostras biológicas complexas.
O HPLC acoplado à espectrometria de massa tandem evoluiu como padrão-ouro para este tipo de quantificação com matrizes biológicas. O estresse oxidativo é um evento comum a diferentes processos fisiopatológicos. Níveis aumentados de adutos de etheno foram detectados em tecidos ou urina de pacientes com doenças inflamatórias.
As lesões de DNA também fornecem informações sobre eventos endógenos desencadeados pela exposição a poluentes. Se as lesões de DNA forem aumentadas, a exposição pode estar no nível que aumenta o risco de desenvolvimento do câncer, por exemplo. As lesões podem ser quantificadas no DNA de qualquer sistema celular e, alternativamente, na urina, plasma, meio de cultura saliva com adaptações na preparação da amostra.
Para começar, use uma placa de cultura colocada no gelo como base para cortar um pedaço de tecido com um bisturi. Pesar um grama do tecido em cada tubo tampado de 50 mililitros para uso imediato. Mantenha o tecido restante em gelo seco antes de armazenar a menos 80 graus Celsius.
Em cada tubo, adicione 10 mililitros da solução comercial de lise celular contendo deferoxamina de 0,5 mililamlar, e mantenha no gelo. Coloque o homogeneizador de tecido em baixa velocidade, em torno de 60 a 90 rpm. Homogeneize os tecidos no gelo por alguns minutos até que a solução esteja sem fragmentos de tecido.
Em seguida, adicione 150 microliters de solução proteinase K a cada amostra homogeneizada. Agite os tubos por inversão, e mantenha-os à temperatura ambiente durante a noite. Pela manhã, adicione 40 microliters de ribonuclease Uma solução, agite pela inversão e mantenha os tubos em temperatura ambiente por duas horas.
Adicione cinco mililitros de solução comercial de precipitação de proteína, vórtice vigorosamente, e centrífuga a 2.000 vezes g, quatro graus Celsius, por 10 minutos. Transfira os supernantes para tubos tampados de 50 mililitros contendo 10 mililitros de isopropanol frio. Inverta os tubos suavemente várias vezes até a observação do DNA precipitado.
Use uma pipeta Pasteur fechada no final para coletar o DNA precipitado. Transfira o DNA coletado para tubos contendo quatro mililitros de tampão Tris de 10 mililitros e deferoxamina de um mililitro em pH 7 para dissolver. Depois que o DNA for completamente dissolvido nos tubos, adicione quatro mililitros de uma solução de clorofórmio contendo 4% de álcool isoamyl em cada tubo.
Inverta os tubos 10 vezes para homogeneização, centrífuga a 2.000 vezes g, quatro graus Celsius, por 10 minutos, e transfira as fases superiores para novos tubos. Repita a lavagem da fase superior com a solução de clorofórmio mais duas vezes. Em seguida, adicione oito mililitros de etanol absoluto e 0,4 mililitros de uma solução de cloreto de sódio de cinco molares para precipitar o DNA.
Novamente, coletar o DNA precipitado, e transferi-lo para três mililitros de 70% de etanol. Repita a lavagem com 70% de etanol mais uma vez. Descarte a solução de etanol com cautela e inverta os tubos contendo o DNA precipitado em papel absorvente para remover o excesso de solução.
Depois de preparar amostras de hidrólise de DNA com padrão isotópico de 1, N6-etheno-desoxyadenosine e padrão isotópico de 15N5 de 1, N2-etheno-deoxyguanosine de acordo com o manuscrito, transfira 10 microliters de cada amostra em tubos para quantificação de desoxynucleosídeos normais por HPLC-UV. Sujeito o volume residual à extração em fase sólida. Para executar o HPLC, primeiro elute uma coluna C18 anexada a um cartucho C18 SecurityGuard com um gradiente de ácido fórmico de 0,1% e metanol.
Configure o programa de gradiente para funcionar de zero a 25 minutos com zero a 18% de metanol, de 25 a 27 minutos com 18 a 0%de metanol, depois de 27 a 37 minutos com 0%metanol a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto e 30 graus Celsius. Depois disso, injete um volume entre dois e seis microliters para cada amostra reservada para quantificação normal de desoxynucleosídeos. Coloque o detector PAI em 260 nanômetros para integração dos picos de desoxiguanosina e desoxiinonosina.
Para realizar a extração em fase sólida para análises de 1, N6-etheno-desoxyadenosine e 1, N2-etheno-deoxyguanosine, primeiro carregue os cartuchos com uma série de soluções a um volume de um mililitro. Adicione 100% de metanol, água deionizada, amostra de DNA hidrolisado, água deionizada, 10% metanol, 15% metanol e, por último, 100% metanol para coleta. Então, prossiga de acordo com o manuscrito.
Após o preparo das amostras de hidrólise de DNA 15N5 padrão isotópico de 8-oxo-desoxyguanosina, transfira 80 microlitadores de cada amostra em frascos para análise no sistema HPLC-ESI-MS/MS. Reserve os 20 microliters restantes para quantificação de desoxyguanosina no HPLC-UV, como feito anteriormente. Para análise de 8-oxo-desoxyguanosine no HPLC-ESI-MS/MS, elute a coluna C18 Acoplado a um cartucho C18 SecurityGuard com um gradiente de solvente A e B a uma taxa de fluxo de 150 microliters por minuto e 25 graus Celsius.
Execute a bomba binária com zero a 15% de solvente B durante os primeiros 25 minutos, 15 a 80% de solvente B de 25 a 28 minutos, 80% de solvente B de 28 a 31 minutos, 80 a 0% de solvente B de 31 a 33 minutos, e 0% de solvente B de 33 a 46 minutos. Direcione os primeiros 16 minutos da coluna A eluente para o lixo. Condição coluna B pela bomba isocrática com uma solução de 15% de metanol na água contendo ácido fórmico de 0,1% a uma taxa de fluxo de 150 microliters por minuto.
Após seis minutos, verifique o cromatógrama para garantir os elutos padrão de 8 oxo-desoxiguanosina da coluna A.Durante o intervalo de 16 a 32 minutos, mude a válvula para a posição permitindo a conexão entre a coluna A e a coluna B.Feche a válvula em 32 minutos para eluto 8-oxo-deoxyguanosine da segunda coluna e obtenha um pico cromatográfico afiado. Para análise de 1, N6-etheno-desoxyadenosine e 1, N2-etheno-desoxyguanosine, elute uma coluna C18 acoplado a um cartucho C18 SecurityGuard com um gradiente de solvente A e B a uma taxa de fluxo de 130 microliters por minuto e 25 graus Celsius. Execute a bomba binária com 0% de solvente B durante os primeiros 10 minutos, zero a 20% do solvente B por 10 a 39 minutos, 20 a 75% de solvente B de 39 a 41 minutos, 75% do solvente B de 41 a 46 minutos, 75 a 0% de solvente B de 46 a 47 minutos, e 0% de solvente B de 47 a 60 minutos.
Use a válvula de comutação para direcionar os primeiros 35 minutos de eluent para o desperdício e a fração de 35 a 42 minutos para a fonte ESI. Certifique-se de que os padrões de aduto elute da coluna no intervalo definido. Integre os picos de 8-oxo-desoxyguanosine 15N5 padrão isotópico de 8-oxo-desoxyguanosine, 1, N6-etheno-deoxyadenosine, 15N5 padrão isotópico de 1, N6-etheno-deoxyadenosine, 1, N2-etheno-deoxyguanosine, e 15N5 padrão isotópico de 1, N2-etheno-deoxyguanosine das análises HPLC-ESI-MS/MS.
Calcule as razões de área para as curvas de calibração e as amostras. Estabeleça as curvas de calibração e calcule as quantidades de lesões em cada amostra injetada. Integre os picos de desoxyguanosina e desoxyadenosine das análises HPLC-UV.
Use as áreas para estabelecer as curvas de calibração e calcular as quantidades de desoxiguanosina e desoxiinonosina em animais em cada amostra injetada. Calcule as frações molares para 8-oxo-desoxyguanosine sobre desoxiguanosina, 1, N6-etheno-deoxyadenosine sobre desoxyadenosine, e 1, N2-etheno-deoxyguanosine sobre desoxyguanosine, que dão o número de lesões por um milhão de desoxyguanosina normal ou denosyadeine. Um cromatógrafo representativo do DNA purificado obtido pelo HPLC-UV mostra a presença dos quatro desoxirimentos normais, livres das ribonucleosídeos de RNA, demonstrando a pureza do DNA.
Cromatógramas representativos do HPLC-ESI-MS/MS de 8-oxo-desoxyguanosina, 1, N6-etheno-deoxyadenosine, e 1, N2-etheno-deoxyguanosine em amostras de DNA de tecido de camundongos são mostrados. O cromatógrama obtido com a detecção de UV mostra os quatro desoxinucleosídeos normais eluvando da primeira coluna até cerca de 10 minutos, com uma boa separação de 8-oxo-desoxyguanosine, eliminando interferências indesejadas. Uma coisa importante a ser lembrada para quantificações exatas é ter sempre as mesmas quantidades de padrões internos no volume de injeção nas curvas de calibração e amostras.
Os métodos aqui apresentados podem ser adaptados para a quantificação de outros desoxiúmônios modificados. A expansão da banda de desoxynucleosídeos modificados permite uma melhor compreensão dos mecanismos fisiofisiológicos subjacentes. Podemos investigar o papel dos danos oxidativos em diferentes situações, como exposição a xenobióticos, diabetes e transformação maligna celular, auxiliando, assim, o desenvolvimento de estratégias preventivas e de tratamento.
