O ensaio ddTRAP fornece a capacidade de obter uma medição sensível, robusta e altamente quantitativa da atividade enzimática telomerase nas células. A capacidade de executar até 96 amostras por corrida em uma moda de rendimento médio nos oferece uma grande vantagem. Podemos executar os controles e réplicas para análise estatística adequada sobre os dados coletados.
Imediatamente antes do lising celular, descongele uma alíquota congelada do tampão de lise NP-40. Uma vez descongelado, coloque o tampão de lise no gelo. Adicione o inibidor de protease PMSF ao tampão de lise NP-40 para atingir uma concentração final de 0,2 mililitro.
Em seguida, adicione 40 microliters do tampão de lise ao tubo contendo uma pelota celular para atingir uma equivalência celular de 25.000 células por microliter. Pipeta suavemente o lise para cima e para baixo, a fim de quebrar as células. Tente evitar fazer bolhas.
Deixe as células lise no gelo por 30 minutos. Vórtice suavemente o lysate a cada 10 minutos para evitar que aglomerados de detritos celulares se formem. Durante a lise celular, prepare uma mistura mestra em um tubo de microcentrifuge para a reação de extensão de telomerase, e armazene no gelo.
Após a lise celular, pipetas 48 microliters de extensão mestre se misturam em cada tubo PCR. Adicione dois microliters de diluído em cada tubo PCR para alcançar uma equivalência celular final de 50 células por microliter, e continue a reação de extensão de telomerase de acordo com o manuscrito. Prepare uma mistura mestra em um tubo de microcentrifuuagem para o ddTRAP, e mantenha-o em temperatura ambiente.
Pipeta 19,8 microliters de ddPCR master mix em cada tubo PCR. Adicione 2,2 microliters da solução de reação de extensão anterior a cada tubo, deixando um volume total de 22 microliters. Para configurar o cartucho de geração de gotículas, primeiro carregue 20 microliters da solução preparada para a amostra média bem no cartucho.
Toque suavemente na lateral do cartucho para mover quaisquer bolhas para a parte superior da solução. Todos os poços do cartucho devem ser carregados com amostra antes do óleo de carregamento. Em seguida, carregue 70 microliters de óleo de geração de gotículas no poço de óleo esquerdo.
Fixar a junta no lugar amarrando-a nas extremidades do cartucho e coloque o cartucho carregado e montado no gerador de gotículas. O gerador mostra uma luz verde sólida para informar que o cartucho está bem colocado. Após 60 a 90 segundos, quando a luz do gerador pára de piscar, o ciclo está completo.
Agora remova o cartucho. Remova suavemente a junta do cartucho. Use uma pipeta multicanal para pipetar aproximadamente 40 microliters das gotículas recém-geradas do poço direito em uma placa PCR de 96 poços.
Aqueça a placa com selos de placa pcr de alumínio uma vez que todas as amostras são carregadas na placa de 96 poços para evitar a evaporação. Em seguida, carregue a placa de 96 poços em um termociclador para executar a reação do PCR. Para começar, carregue a placa de 96 poços no leitor de gotículas.
Oriente a placa corretamente para que a amostra A1 corresponda à do suporte. Abra o software associado ao leitor de gotas. Clique duas vezes no primeiro poço, A01, para abrir a tela do editor do poço de amostra.
Clique em Experimentar e selecione o tipo de ensaio a ser usado no menu suspenso. Selecione QX200 ddPCR EvaGreen Supermix como o método de detecção correto. Clique em Aplicar no lado inferior direito da tela do editor do poço para salvar as configurações definidas pelo usuário em todos os poços destacados.
Em seguida, clique em Segmentar na tela do editor do poço e clique no menu suspenso do Target para selecionar controle desconhecido, de referência ou sem modelo para definir o tipo de amostra. Na seção Nome da amostra, rotule todas as amostras e clique em Aplicar. Clique em Executar para ler a placa.
Selecione colunas ou linhas na tela Opções de execução quando solicitado a informar sobre a orientação em que a placa deve ser lida. Determine o número de gotículas aceitas para cada amostra clicando duas vezes nos poços ou cabeçalhos de coluna e linha individuais para fornecer uma tabela de informações. Para o ddTRAP, amostras com gotículas aceitas de 10.000 ou mais são válidas para análise posterior.
Destaque os poços que representam réplicas de amostras e amostras de NTC. Defina manualmente o limiar das amostras clicando no ícone para definir limiares no canto inferior esquerdo da tela. Neste protocolo, a atividade de telomerase foi medida em um painel celular composto por nove linhas celulares de câncer de pulmão e fibroblastos telomerase-negativos.
Um limiar foi estabelecido em torno de 2.000 amplitude de fluorescência para todas as três réplicas biológicas para SHP77, H2887 e NTC. Gotículas positivas tiveram uma intensidade de fluorescência em torno de 6.000 amplitude de fluorescência, que formaram uma população clara no topo, e separadas de gotículas negativas em torno de 1.100 amplitude de fluorescência. Os produtos de extensão de telomerase totais por célula equivalente entre todas as amostras foram estimados a partir da concentração medida dos ácidos nucleicos, o que representa a atividade telomerase nas linhas de câncer de pulmão.
Qualquer contaminação de RNase durante as etapas de reação de lise ou extensão destruirá a atividade enzimática telomerase, uma vez que é um complexo de ribonucleoproteína. ddTRAP pode ser acompanhado com ddPCR nos níveis de expressão mRNA hTERT na célula. Os dois conjuntos de dados nos permitem correlacionar a expressão do hTERT com a atividade de telomerase e aprofundar-se em potenciais mecanismos regulatórios de telomerase, como emendas alternativas.
Podemos explorar manipulações para fatores específicos de emenda e seus efeitos sobre a atividade de telomerase. Atualmente, estamos projetando moduladores de oligonucleotídeos como potenciais medicamentos voltados para a atividade de telomerase.
