Entre as diferentes estratégias de produção de proteína recombinante nas plantas, a expressão VERS baseada em plantas desconstruída proporciona desempenho superior, levando a altos rendimentos em um período relativo curto de tempo. A replicação dessa tecnologia para a produção de uma vacina oral tem um grande potencial para se tornar uma alternativa às vacinas convencionais em um futuro próximo. As folhas de beterraba vermelha liofilizadas transformadas transitoriamente acumulam uma quantidade de antígenos fotográficos adequados para indução de tolerância oral na prevenção do diabetes tipo um.
Este protocolo experimental poderia ser estendido a muitas espécies comestíveis diferentes após uma avaliação caso a caso do acúmulo de proteínas recombinantes. Os que demonstrarão o procedimento serão Edoardo Bertini, Mattia Santoni, Anna Cuccurullo e Roberta Zampieri. Para iniciar esse procedimento, plante plantas de beterraba vermelha e espinafre em uma câmara de crescimento, conforme descrito no protocolo de texto.
Após a germinação das sementes, fertilize as plantas duas vezes por semana com uma solução de fertilizante comercialmente disponível a uma concentração de um grama por litro. Para agroinfiltração, use espinafre de cinco semanas e plantas de beterraba vermelha de seis semanas. Após a construção dos vetores de expressão vegetal, inocular os três transformadores A.tumefaciens em 50 mililitros de meio LB contendo rifampicina a uma concentração de 50 microgramas por mililitro e antibióticos específicos do vetor, conforme descrito no protocolo de texto.
Cresça tremendo durante a noite a 28 graus Celsius. No dia seguinte, pelota as culturas bacterianas por centrifugação a 4500 vezes G por 20 minutos. Resuspend a pelota em 100 mililitros de tampão de infiltração contendo 10 milimôlares MES e 10 mililitros de magnésio sulfato.
Incubar as suspensões em temperatura ambiente por três horas. Misture um volume igual de uma suspensão bacteriana contendo um dos módulos aqui mostrados, com o módulo cinco prime e o módulo integrase. Usando uma seringa sem agulha, tire cinco mililitros da mistura de suspensão.
Pressione a ponta da seringa contra a parte inferior da folha de plantas enquanto aplica suavemente contra a pressão do outro lado da folha. Infiltrar-se nas três primeiras folhas completamente expandidas, a partir do ápice, para cada planta. Rotule as folhas agroinfiladas com a etiqueta de papel na haste da folha.
Em seguida, devolva as plantas à câmara de crescimento em condições padrão. Nos dias quatro a 14 pós-infecção, recolhe as folhas agroinfiladas e congela-as em nitrogênio líquido. Armazene este tecido vegetal a menos 80 graus Celsius.
Primeiro, cultivar separadamente os três transformadores A.tumefaciens em 50 mililitros de meio LB contendo rifampicina a uma concentração de 50 microliters por mililitro, e antibióticos específicos de vetores apropriados balançando durante a noite a 28 graus Celsius. No dia seguinte, pelota as culturas bacterianas por centrifugação a 4500 vezes G por 20 minutos. Resuspente a pelota em 1 litro de tampão de infiltração para um OD600 de 0,35, e incubar as suspensões em temperatura ambiente por três horas.
Em seguida, adicione 0,01% do detergente a cada suspensão. Misture um volume igual de uma suspensão bacteriana contendo um dos módulos aqui mostrados com o módulo cinco prime e o módulo integrase. Insira uma planta de beterraba vermelha de seis semanas no suporte.
Inverta o suporte e coloque-o em cima de um béquer contendo dois litros de um banho de infiltração para submergir as folhas na suspensão de infiltração. Depois disso, transfira o banho de infiltração com a planta submersa para a câmara de infiltração e feche-a. Ligue a bomba de vácuo e abra a válvula de admissão de vácuo na câmara de infiltração.
Uma vez que a pressão na câmara tenha caído para 90 milibar, mantenha o vácuo por três minutos. Em seguida, solte o vácuo por 45 segundos. Quando a câmara voltar à pressão atmosférica, abra a câmara e remova a planta infiltrada do banho bacteriano.
Devolva a planta para a câmara de crescimento. No dia da expressão máxima, colhia as folhas infiltradas e congele-as em nitrogênio líquido como descrito anteriormente. Primeiro, colher o delta agroinfilto de vácuo 87 GAD65mut expressando folhas de beterraba vermelha no pico de expressão, e congelá-las em nitrogênio líquido.
Lyophilize as folhas congeladas a menos 50 graus Celsius e a 0,04 milibar por 72 horas. Em seguida, armazená-los a menos 80 graus Celsius. Quando estiver pronto para prosseguir, triture as folhas em um pó fino e guarde à temperatura ambiente em um recipiente selado com gel de sílica para excluir a umidade.
Para a simulação de digestão gástrica, pesar 100 miligramas das folhas de beterraba vermelhas finamente congeladas e resuspensá-la em seis mililitros de PBS. Use seis ácidos clorídricos molares para ajustar o pH da amostra a dois. Adicione quatro miligramas por pepsina mililitros da mucosa gástrica suína, e 10 milimólars de ácido clorídrico, para obter uma concentração final de pepsina de um miligrama por mililitro.
Agite a amostra a 37 graus Celsius por 120 minutos. Em seguida, use hidróxido de sódio para ajustar o pH amostral para oito e inativar a pepsina. Transfira 750 alíquotas de microliter de cada amostra para tubos de microcentrifuuagem, e centrifugar as alíquotas a 20.000 vezes G e a quatro graus Celsius por 20 minutos.
Colete cada supernante separadamente e resuspense cada pelota em um volume supernacante de buffer de carregamento. Em seguida, analise tanto o supernasal quanto a pelota resuspended pela análise de manchas ocidentais. Para a análise de integridade celular, prepare duas amostras de 100 miligramas das folhas de beterraba vermelha finamente secas e resuspenque ambos em seis mililitros de PBS.
Use seis ácidos clorídricos molares para ajustar o pH de uma amostra a duas. Agite ambas as amostras a 37 graus Celsius por 120 minutos. Em seguida, alíquota de 750 microliters de cada amostra para microcentrifugar tubos.
Centrifugar a 20.000 vezes G e a 4 graus Celsius por 20 minutos. Colete cada supernante separadamente e resuspense cada pelota em um volume supernacante de buffer de carregamento. Em seguida, analise tanto o supernasal quanto a pelota resuspended pela análise de manchas ocidentais.
Primeiro, pese 100 miligramas das folhas de beterraba vermelha finamente secas e resuspensá-la em oito mililitros de PBS estéreis. Vórtice por um minuto. Placa um mililitro de cada folha congelada homogeneizar em uma das cinco mídias lb seletivas preparadas.
Incubar as placas a 28 graus Celsius por três dias. Depois disso, conte as colônias de agrobacterium cultivadas em cada placa, e calcule a carga bacteriana residual como o número de unidades formadoras de colônias por mililitro da folha congelada homogeneizado. Neste trabalho, uma vacina oral é desenvolvida em tecido vegetal comestível.
As plantas de beterraba vermelha e espinafre são manualmente agroinfiladas com suspensões de A.tumefaciens carregando vetores de expressão recombinantes EGFP, e a expressão de proteína fluorescente é visualizada pela análise da mancha ocidental e quantificada sob luz UV. O sistema de beterraba vermelha é caracterizado por uma expressão EGFP mais alta, atingindo aproximadamente 544 microgramas por grama de peso de folha fresca em nove dias após a infecção, enquanto o espinafre atingiu apenas um nível máximo de aproximadamente 113,4 microgramas por grama de peso de folha fresca em 11 dias após a infecção. Por causa disso, a beterraba vermelha é selecionada como o hospedeiro de expressão para todos os experimentos subsequentes.
As plantas são então infiltradas a vácuo com uma suspensão de a.tumefaciens. Após a extração de TSP a partir de folhas de agroinfiltração, as amostras são analisadas por mancha ocidental, e a proteína recombinante é relativamente quantificada por uma análise de densitometria. Por fim, são avaliados os parâmetros para o desenvolvimento de uma potencial vacina oral.
Como visto aqui, a proteína alvo é vista como estável após o processo de liofilização. A digestão gástrica é simulada adicionando a pepsina de enzima gástrica suína ao material liofilizado, seja a uma concentração final de um miligrama por mililitro, ou uma razão de 1 a 20, ao TSP. Ambas as condições de tratamento digestivo resultam em degradação da proteína recombinante.
A ausência de um sinal específico nas amostras de pelotas após a digestão da pepsina sugere que após a secagem congelante, as células vegetais perderam sua integridade, e isso levou à degradação da proteína alvo. O procedimento deve ser cuidadosamente adaptado às espécies vegetais em relação à infiltração a vácuo e à proteína recombinante alvo em relação à análise do curso de tempo. O procedimento de demonstração também pode ser utilizado para a produção de biofarmacêutico destinado à entrega oral, como vacina e anticorpos.
