Pesquisas sobre biologia de gotículas lipídicas têm sido dificultadas pela dificuldade de purificação. Além disso, estudar o fluxo lipíduo celular requer purificação simultânea de múltiplas organelas, e nenhum protocolo simples estava disponível atualmente. A principal vantagem dessa técnica é tornar a purificação de gotículas lipídicas mais acessível.
Modificamos um kit comercialmente disponível para isolar simultaneamente gotículas lipídicas, ânticulo endoplasmático e lisesos de uma única amostra. O acúmulo de gotículas lipídicas predispõe pacientes obesos e alcoólatras à doença hepática progressiva. Isso mudou a visão das gotículas lipídicas de compartimentos de armazenamento inertes para organelas biologicamente importantes dinâmicas.
Para começar, use fórceps estéreis e uma tesoura de dissecção para cortar a pele e as camadas musculares do abdômen do camundongo eutanizado no eixo posterior-anterior, expondo o fígado. Corte os ligamentos ligando o fígado ao intestino. Usando fórceps, puxe o intestino para longe do fígado, em direção ao posterior.
Corte o ligamento ligando o fígado ao diafragma. Em seguida, corte entre o fígado e a caixa torácica dorsal, movendo-se de anterior para posterior, até que o fígado seja liberado. Transfira o fígado para uma placa de Petri fria de cinco centímetros com 10 mililitros de PBS frio 1x, e lave o fígado duas vezes em uma plataforma de balanço em 10 mililitros de 1x PBS frios por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Após a lavagem final, despeje o PBS 1x, e use uma lâmina cirúrgica estéril tamanho 10 para colocar o fígado em pedaços de três a cinco milímetros dentro do prato. Em seguida, lave o fígado picado duas vezes com 10 mililitros de 1x PBS frios por cinco minutos a quatro graus Celsius. Decante o 1x PBS, e transfira as peças de fígado picados para um homogêneo Dounce frio de 45 mililitros, garantindo que todas as peças estejam na parte inferior.
Adicione sete mililitros de tampão 1x IE frio. Homogeneize-se no gelo movendo o pilão para cima e para baixo 20 vezes, certificando-se de que o pilão vá para o fundo do homogeneizador durante cada golpe. Transfira o homogeneado para um tubo de centrífuga de 15 mililitros frios.
Enxágüe o homogeneizador com um mililitro de tampão 1x IE frio e adicione-o ao resto do homogeneizado. Para remover núcleos, centrifugar o homogeneizar em uma centrífuga de alta capacidade a 1.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Certifique-se de que qualquer lipídio recolhido na parte superior do tubo de 15 mililitros seja resuspendido para evitar a perda de LD.
Certificando-se de que a pelota nuclear na parte inferior do tubo não está perturbada, transfira o supernanato pós-nuclear contendo lipídios para um tubo de centrífuga frio fresco de 50 mililitros. Transfira uma alíquota de 100 microliter do supernanato pós-nuclear para um tubo frio de microcentrífuga de 1,7 mililitro no gelo para análise posterior da pureza. Para remover mitocôndrias, centrifugar a amostra de supernante pós-nuclear em uma centrífuga de alta velocidade refrigerada a 12.000 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius.
Certifique-se de que qualquer lipídico recolhido na parte superior do tubo é resuspended para evitar a perda de LD, e, em seguida, transferir o supernatante pós-mitocondrial para um tubo ultracentrífado de 13 mililitros. Transfira uma alíquota de 100 microliteres do supernatante pós-mitocondrial para um tubo frio de microcentrífuga de 1,7 mililitro no gelo para análise posterior da pureza. Encha o tubo de ultracentrícula com supernaciante pós-mitocondrial até a borda com tampão 1x IE frio, para evitar que ele entre em colapso durante a ultracentrifugação.
Equilibre as amostras e, em seguida, centrífuga em uma ultracentrifuagem a 100.000 vezes g por 60 minutos a quatro graus Celsius. Para remover a camada LD, incline o tubo em um ângulo de 45 graus e aspire com uma pipeta de vidro. Depois de transferir a pelota para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros frio, colete 100 microlitres do supernatante pós-ER sob a camada lipídica para análise de pureza.
Para pellet qualquer detrito celular, centrífuga em uma microcentrifuagem em alta velocidade por cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, aqueça o tubo suavemente com as mãos para ajudar a resuspensar a camada LD, e transfira o supernante, incluindo a camada lipídica, para um novo tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro. Repita estas etapas de lavagem, aquecendo o tubo duas a três vezes, até que a pelota não esteja mais visível.
Em seguida, para lavar o supernanato LD sem pelotas, adicione 1x PBS a um volume final de 1,5 mililitros, e centrífuga em uma microcentrifuagem em velocidade máxima por cinco minutos a quatro graus Celsius. Use uma pipeta de vidro para remover um mililitro de 1x PBS, que está sob a camada lipídica, sem perturbar a camada lipídica. Repita a lavagem de LD de quatro a cinco vezes, até que o 1x PBS seja visualmente transparente sem turbidez.
Em seguida, use uma pipeta de vidro para remover todos os PBS 1x abaixo da camada lipídica e use a fração LD pura resultante para análise a jusante. Quando as imagens LD fluorescentes e brilhantes representativas de 20x foram tiradas tanto do isolamento LD do kit ER quanto dos métodos de isolamento de LD de sacarose, eles revelaram níveis semelhantes de material particulado, sugerindo purezas semelhantes usando dois protocolos diferentes. Após a purificação, os níveis de triglicerídeos e proteínas LD foram medidos utilizando-se assins de assimetria colorimétrica, e os dados foram normalizados para o peso do fígado, mostrando que quando o material inicial foi normalizado, o triglicerídeo LD e os rendimentos proteicos foram semelhantes utilizando o kit ER e o método de sacarose.
Os diâmetros de LD foram quantificados por meio de um software de análise de imagem, mostrando que o isolamento LD do kit ER e o isolamento de LD de sacarose produziram LDs de tamanhos semelhantes. Para avaliar a pureza da LD, as amostras foram avaliadas por imunoblotting, mostrando que os LDs derivados do isolamento LD do kit ER e do protocolo de gradiente de sacarose ambos tinham pureza igual. PLIN2, um marcador LD, foi detectado em todas as amostras, exceto no isolamento LD do kit ER PER e na PNS da sacarose.
A análise de pureza de uma fração de ER usando imunoblots mostra que eles estavam livres do marcador LD PLIN2, mas tinham níveis significativos da proteína ER SEC61A. Também foi avaliada a pureza de uma fração lisesomal após a purificação de lisesomos usando o kit de enriquecimento lysossomo. Discovery é atualmente a aplicação mais útil do nosso protocolo.
Realizamos lipidomics em organelas purificadas, e mostramos que as lipotoxinas são aumentadas especificamente em gotículas lipídicas em doença hepática alcoólica.
