A Micro TC não tem sido amplamente aplicada aos invertebrados marinhos devido à sua diversidade na morfologia. Nosso método permite a fácil montagem de amostras em qualquer ângulo adequado para sua morfologia. Pode ser realizado com materiais comuns, como água, argila e tubos, e se aplicável, a amostras com uma variedade de formas, de um verme longo a uma bola redonda.
Demonstrando o procedimento estará Akiteru Maeno, técnico do Instituto Nacional de Genética do Japão. Para começar, prepare 0,5% de agarose dissolvendo 500 miligramas de agarose em 100 mililitros de água destilada em um frasco cônico de 250 mililitros, e coloque o frasco em um micro-ondas com a potência de 800 watts para aquecer cerca de um a três minutos. Esfrie o frasco à temperatura ambiente.
Para montar grandes amostras que não se encaixam em uma ponta azul de micropipette de 1000 microliteres, como A.equina, primeiro coloque a amostra manchada em um prato de 60 milímetros com água destilada para lavar a solução de coloração excessiva da superfície. Em um tubo de 50 mililitros, despeje suavemente cinco mililitros de 0,5% de agarose sem fazer bolhas. Coloque o tubo no gelo para endurecer a agarose.
Em seguida, adicione 20 mililitros de 0,5% de agarose ao tubo, coloque no gelo até que a agarose comece a endurecer, e use fórceps para colocar o espécime dentro da ágarose. Ajuste a posição da amostra para que seu eixo corporal seja vertical. Endureça a ágarose no gelo.
Coloque argila no estágio de montagem do microCT e coloque o tubo de 50 mililitros na argila. Para montar pequenas amostras que se encaixam em uma ponta azul de micropipette de 1000 microliter, como Harmothoe sp. e X.japonica, decante a amostra manchada em um prato de 60 milímetros sem o uso de fórceps.
Com pinças de anel, transfira suavemente as amostras para outro prato de 60 milímetros cheio de água destilada para lavar a solução de coloração excessiva da superfície. Em seguida, elave 100 microliters de 0,5% surgiram em uma ponta azul de micropipette de 1000 microlitares e coloque-a no gelo para endurecer. Ao manusear Harmothoe sp.
adicionar 1000 microliters de 0,5% agarose no plugue de agarose na ponta. Use pinças de anel para transferir suavemente Harmothoe sp. do prato de 60 milímetros para a solução agarose na ponta.
Com uma agulha petiolato ou pinças de precisão, ajuste a posição e orientação do harmothoe sp. para que o chaetae não seja dobrado de forma não naturalmente. Certifique-se de que não há bolhas presentes e, em seguida, coloque a ponta no gelo para endurecer a agarose.
Ao manusear amostras frágeis como X.japonica, use uma micropipette para adicionar 1000 microliters de água destilada na ponta azul com o plugue de agarose endurecido. Posicione o X.Japonica na água destilada para que fique estável entre as paredes da ponta. Para amostras menores, pode-se usar uma ponta amarela de micropipette de 200 microliptos.
Neste caso, use 30 microliters de agarose para o plugue, e adicione 200 microliters de agarose ou água destilada. Em seguida, corte a ponta de uma nova ponta azul de micropipette de 1000 microliter, e insira a ponta da ponta plugada na nova ponta. Coloque argila no estágio de montagem do microCT e coloque as pontas com a amostra dentro na argila.
Imediatamente após a montagem das amostras, ligue o feixe de raios-X a 80 quilovolts e 100 microamps. Ao observar a imagem de transmissão de raios-X, mova o estágio para que toda a amostra possa ser vista clicando nos botões do eixo x e z, e ajustando manualmente o botão do eixo y no estágio de montagem. Ajuste as condições de contraste da imagem para que as estruturas internas possam ser observadas.
Ajuste a orientação da amostra alterando o ângulo do tubo na argila. Gire o estágio 90 graus definindo o eixo de rotação para 90 e clicando no botão Movimento Relativo. Faça a mesma manobra quatro vezes para completar uma rotação completa.
Desligue manualmente o feixe de raios-X cada vez que a porta da amostra for aberta, a menos que o sistema o desligue automaticamente. Agora clique no botão do eixo z e ajuste manualmente o botão do eixo y para mover o estágio de montagem para que a amostra esteja no centro da vista. Gire o palco em 90 graus e ajuste a amostra para o centro novamente.
Gire o estágio 90 graus mais três vezes, e ajuste conforme necessário para ter certeza de que a amostra está no centro da vista de todas as direções. Em seguida, clique no botão x-axis para mover o palco ao longo do eixo x em direção à fonte do feixe de raios-X para ampliar a amostra e ajustar conforme necessário para que ele apenas se encaixe na vista. Gire o palco e ajuste conforme necessário para ter certeza de que a amostra se encaixa na vista de todas as direções.
Ajuste as condições de digitalização e comece a digitalizar. Neste experimento, a imagem microCT foi realizada em Actinia equina, Harmothoe sp. e Xenoturbella japonica após coloração com solução de 25% Lugol.
A coloração melhorou com sucesso o contraste das estruturas internas em todos os espécimes, permitindo observações de tecidos moles internos. Este método é aplicável a espécimes frágeis mesmo com danos externos, como pode ser visto a partir da amostra X.japonica com epiderme gravemente danificada. Um único conjunto de dados de alta resolução de um espécime inteiro foi reconstruído para Harmothoe sp.
e X.japonica de múltiplos escaneamentos realizados em diferentes partes, mas sobrepostas da amostra. Certifique-se de definir a amostra no tubo ou ponta e montar o tubo ou ponta no microCT para que ele não se mova durante a varredura. Os dados obtidos a partir deste procedimento podem ser utilizados para reconstruções de imagem 3D, permitindo ao pesquisador compreender plenamente a morfologia interna e externa da amostra.
Todos os sistemas microCT usam raios-X, mas as especificidades podem ser diferentes de um sistema para outro, por isso, certifique-se de seguir de perto as instruções de cada sistema.
